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1、微生物学实验生物科学基地班、创新班、生物工程、生物技术、食用菌等专业共用任课教师： 熊 芳教学时数：20学时实验周数：4周生物学实验教学中心微生物实验室微生物实验目录20学时实验一：培养基的配制实验二：高压蒸汽灭菌实验三：土壤自生固氮菌的别离纯化实验四：稀释平板计数法实验五：显微镜的使用实验六：微生物的显微直接计数法血球计数板实验七：细菌的简单染色与革兰氏染色实验八：细菌的荚膜染色实验九：黑曲霉水浸片的制备与观察微生物学实验规那么和平安普通微生物学实验课的目的是：训练学生掌握微生物学最根本的操作技能，了解微生物学的根本知识，加深理解课堂讲授的某些微生物学理论。同时，通过实验，培养学生观察、思考
2、、提出问题、分析问题和解决问题的能力，实事求是、严肃认真的科学态度以与敢于创新的开拓精神；树立勤俭节约、保护公物的良好作风。微生物学实验室是一个严肃的实验场所，虽然普通微生物学实验所用的微生物材料一般为非致病菌或条件致病菌，但许多微生物是否具有致病性不是绝对的，与其数量、条件、感染途径等有关，所以在实验操作中，必须将所有的微生物培养物都看成是具有潜在致病性的。为了上好微生物学实验课，并保证平安，特制定如下规那么和平安措施：1.每次实验前必须对实验内容进行充分预习，以了解实验的目的、原理和方法，做到心中有数，思路清楚。2在整个实验过程中必须穿上实验服，留长发者，必须将长发挽在背后。实验台上除了记
3、录本和笔(记录笔和记号笔)以外，不准堆放任何个人物品。3认真与时做好实验记录，对于当时不能得到结果而需要连续观察的实验，那么需记下每次观察的现象和结果，以便分析。4实验室内应保持整洁，勿高声谈话和随便走动，保持室内安静。5实验时小心仔细，全部操作应严格按照操作规程进行，禁止用嘴吸取菌液或试剂，万一遇有盛菌试管或瓶不慎打破、皮肤破伤等意外情况发生时，应立即报告指导教师，与时处理，切勿隐瞒。6实验过程中，切勿使乙醇(酒精)乙醚、丙酮等易燃药品接近火焰。如遇火险，应先关掉火源，再用湿布或沙土掩盖灭火。必要时用灭火器。7使用显微镜或其他贵重仪器时，要求细心操作，特别保护。显微镜的目镜在使用前后必须用浸
4、有乙醇(酒精)的透镜纸擦净。对消耗材料和药品等要力求节约，用毕后仍放回原处，严禁将药匙交叉使用。8每次实验完毕后，必须把所用仪器抹净放妥，将实验室收拾整齐，擦净桌面，如有菌液污染桌面或其他地方时，可用3%来苏尔液或5%石炭酸液覆盖半小时后擦去，如系芽孢杆菌，应适当延长消毒时间。凡带菌之工具(如吸管、玻璃刮棒等)在洗涤前须浸泡在3%来苏尔液中进行消毒。9每次实验需进行培养的材料，应标明自己的组别与处理方法，放于教师指定的地点进行培养。实验室中的菌种和物品等，未经教师许可，不得携出室外。10每次实验的结果，应以实事求是的科学态度填入报告表格中，力求简明准确，认真答复思考题，并与时汇交教师批阅。11
5、离开实验室前将手洗净，注意关闭门窗、灯、火、煤气等。实验一 培养基的配制一、实验目的学会一般培养基的制备原理、方法。二、实验原理培养基是按照微生物生长繁殖所需要的各种营养物质用人工方法配制而成的机制。其中含有水分、碳水化合物、含氮化合物、无机盐与各种必要的维生素。培养基可以为微生物的生长提供能源、组成菌体细胞的原理与调节代谢活动。由于不同微生物的营养类型不同，对营养物质的要求也各不相同，因此，需要配制不同种类的培养基。一般培养细菌常用牛肉膏蛋白胨培养基，培养放线菌常用淀粉培养基，培养霉菌常用马铃薯培养基，培养酵母常用麦芽汁培养基。培养基除了要满足微生物生长所需要的各种营养物质外，还应保证微生物
6、所需要的其他生活条件，如适宜的酸碱度、渗透压等，因此，根据不同种类微生物的要求，应将培养基调节到一定的pH范围，如细菌培养基中性偏碱，放线菌培养基偏碱，霉菌、酵母菌培养基偏酸。根据研究的不同，可以将培养基制成固体、半固体和液体三种形式，固体培养基的成分与液体相同，仅在液体培养基中参加凝固剂作为支持物，通常参加1.5%-2%的琼脂，半固体参加0.3%-0.5%琼脂作为支持物，有时也可以用明胶或是硅胶作为凝固剂。三、实验材料以牛肉膏蛋白胨培养基为例1溶液和试剂牛肉膏，蛋白胨，NaCl，琼脂，1mol/LnaOH，1mol/LHCl。2仪器或其他用具试管，三角瓶，烧杯，量筒，玻棒，培养基分装器，天平
7、，牛角匙，高压蒸气灭菌锅，pH试纸pH5.59.0，棉花，牛皮纸，记号笔，麻绳/皮筋，纱布等。四、操作步骤1称量：按培养基配方比例依次准确地称取牛肉膏，蛋白胨，NaCl放入烧杯中。牛肉膏常用玻棒挑取，放在小烧杯或外表皿中称量，用热水溶化后倒入烧杯。蛋白胨很易吸湿，在称取时动作要迅速。2溶化：在上述烧杯中先参加少于所需要的水量，用玻棒搅匀，然后，在石棉网上加热，或在磁力搅拌器上加热溶解。将药品完全溶解后，补充水到所需要的总体积，如果配制固体培养基时，将称好的琼脂放入已溶的药品中，再加热溶化，最后补足所损失的水分。在制备用三角瓶盛固体培养基时，一般也可先将一定量的液体培养基分装于三角瓶中，然后按1
8、.5%2.0%的量将琼脂直接分别参加各三角瓶中，不必加热溶化，而是灭菌和加热溶化同时进行，节省时间。在琼脂溶化过程中，应控制火力，以免培养基因沸腾而溢出容器。同时，需不断地搅拌，以防琼脂培糊底烧焦。配制培养基时，不可用铜或铁锅加热溶化，以免离子进入培养基中。3调pH在未调pH前，先用精密pH试纸测量培养基的原始pH值，如果偏酸，用滴管向培养基中逐滴参加1mol/LNaOH,边加边搅拌，并随时用pH试纸测其pH，直至pH达7.6。反之，用1mol/LHCl进行调节。对于有些要求pH较精确的微生物，其pH的调节可用酸度计进行。pH不要调过头，以免回调而影响培养基内各离子的浓度。配制pH低的琼脂培养
9、基时，假设预先调好pH并在高压蒸气下灭菌，那么琼脂因水解而不能凝固。4过滤趁热用滤纸或多层纱布过滤，以利某些实验结果的观察。一般无特殊要求的情况下，这一步可以省去。5分装如图1.1按实验要求，可将配制的培养基分装入试管内或三角烧瓶中。 液体分装分装高度以试管高度的1/4左右为宜。分装三角瓶的量那么根据需要而定，一般以不超过三角瓶容积的一半为宜，如果是用于振荡培养用，那么根据通气量的要求酌情减少；有的液体培养基在灭菌后，需要补加一定量的其他无菌成分，如抗生素等，那么装量一定要准确。图1.1 分装培养基图示与将试管包扎成捆 固体分装分装试管，其装量不超过管高的1/5，灭菌后制成斜面。分装三角瓶的量
10、以不超过三角瓶容积的一半为宜。 半固体分装试管一般以试管高度的1/3为宜，灭菌后垂直待凝。分装过程中，注意不要使培养基沾在管瓶口上，以免沾污棉塞而引起污染。6加塞包扎：加塞后，将全部试管用麻绳/皮筋捆好，再外包一层牛皮纸，以防止灭菌时冷凝水润湿塞，其外再用一道麻绳/皮筋扎好。用记号笔注明培养基名称、组别、配制日期。三角烧瓶加塞后，外包牛皮纸，用麻绳以活结形式扎好，使用时容易解开，同样用记号笔注明培养基名称、组别、配制日期。有条件的实验室，可用市售的铝箔代替牛皮纸，省去用绳扎，而且效果好。 灭菌：将上述培养基以0.103Mpa,121，20min高压蒸气灭菌。a) 搁置斜面如图1.2：将灭菌的试
11、管培养基冷却至50左右以防斜面上冷凝水太多，将试管口端搁在玻棒或其他适宜高度的器具上，搁置的斜面长度以不超过试管总长的一半为宜。图1.2 斜面的摆法b) 无菌检查：将灭菌培养基放入37的温室中培养2428h，以检查灭菌是否彻底。阿斯毕无氮培养基甘露醇或蔗糖、葡萄糖10gKH2PO40.2gMgSO4.7H2O 0.2gNaCl 0.2gCaSO4.2H2O 0.1gCaCO35g琼脂 20g水 1000mlPH 7.07.2121灭菌20分钟PDA培养基马铃薯培养基PDA：葡萄糖 20g马铃薯200g将马铃薯削皮，切成1*1厘米的丁块，加水煮到水沸腾20min，纱布过滤留取汁液，将汁液参加培养
12、基中即可。琼脂 20g水1000mlPH 自然121灭菌20分钟五、思考题：1写出你所制备的培养基的配方，并分析其中所含物质对微生物生命活动所起的作用。2培养微生物能否用同一种培养基？细菌、放线菌、霉菌的培养基有何异同？3培养基为什么要调节pH值？所有微生物培养基最适pH值是否相同？实验二 高压蒸汽灭菌一、目的要求1了解高压蒸汽灭菌的根本原理与应用范围。2学习高压蒸汽灭菌的操作方法。二、根本原理高压蒸汽灭菌是将待灭菌的物品放在一个密闭的加压灭菌锅内，通过加热，使灭菌锅隔套间的水沸腾而产生蒸汽。待水蒸汽急剧地将锅内的冷空气从排气阀中驱尽，然后关闭排气阀，继续加热，此时由于蒸汽不能溢出，而增加了灭
13、菌器内的压力，从而使沸点增高，得到高于100的温度。导致菌体蛋白质凝固变性而到达灭菌的目的。在同一温度下，湿热的杀菌效力比干热大，其原因有三：一是湿热中细菌菌体吸收水分，蛋白质较易凝固，因蛋白质含水量增加，所需凝固温度降低，二是湿热的穿透力比干热大；三是湿热的蒸汽有潜热存在，每1克水在100时，由气态变为液态时可放出226kJ千焦的热量。这种潜热，能迅速提高被灭菌物体的温度，从而增加灭菌效力。在使用高压蒸汽灭菌锅灭菌时，灭菌锅内冷空气的排除是否完全极为重要，因为空气的膨胀压大于水蒸汽的膨胀压，所以，当水蒸汽中含有空气时，在同一压力下，含空气蒸汽的温度低于饱和蒸汽的温度。实验室中常用的高压蒸汽灭
14、菌锅有立式、卧式和手提式等几种，其构造如图。本实验介绍手提式和立式高压蒸汽灭菌锅的使用方法。三、实验材料阿斯毕无氮培养基，无菌水，枪头，培养皿，试管，立式高压蒸汽菌锅等。四、操作步骤1首先将内层灭菌桶取出，再向外层锅内参加适量的水，使水面与三角搁架相平为宜。2放回灭菌桶，并装入待灭菌物品。注意不要装得太挤，以免防碍蒸汽流通而影响灭菌效果。三角烧瓶与试管口端均不要与桶壁接触，以免冷凝水淋湿包口的纸而透入棉塞。3加盖，并将盖上的排气软管插入内层灭菌桶的排气槽内。再以两两对称的方式同时旋紧相对的两个螺栓，使螺栓松紧一致，勿使漏气。4用电炉或煤气加热，并同时翻开排气阀，使水沸腾以排除锅内的冷空气。待冷空气完全排尽后，关上排气阀，让锅内的温度随蒸汽压力增加而逐渐上升。当锅内压力升到所需压力时，控制热源，维持压力至所需时间。本实验用 105kg/cm2，1213，20分钟灭菌。5灭菌所需时间到后，切断电源或关闭煤气，让灭菌锅内温度自然下降，当压力表的压力降至0时，翻开排气阀，旋松螺栓，翻开盖子，取出灭菌物品。如果压力未降到0时，翻开排气阀，就会因锅内压力突然下降，使容器内的培养基由于内外压力不平衡而冲出烧瓶口或
