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1、脑脊液的培养与送检首都医科大学附属北京天坛医院唐明忠一、为什么要做细菌培养细菌培养是一个传统的方法，但感染性疾病病原更复杂，病原诊断越来越重要。 近年感染性疾病发生了重大的变化，主要表现在四个方面：一，传统的传染性疾病减少，如 鼠疫、霍乱等传染病现在有下降的趋势。而一些新的感染有上升的趋势，主要表现为院内感 染。二，从病原体来看，传统的病原微生物越来越少，“条件致病菌”成主要病原体。三， 细菌耐药性越来越严重，细菌药敏试验有非常重要的临床意义。四，病毒和真菌性感染问题 严重。现在最突出的问题是细菌耐药。细菌生存3538.5亿年，人类生存2.5万年， 而 抗生素存在了 80年。由于抗生素的发现，
2、在诊断和治疗上都取得了很大的成绩。当时 人们认为随着抗生素发现的越来越多，细菌性感染的问题很快就能够得到解决，其他病原微 生物也会随着这个思路找到一个很好的治疗途径。但最近几年，尤其从70年代以后，细菌 的耐药的情况非常突出。造成诊断和治疗上发生了很大的变化。这是由于细菌的耐药造成的。细菌耐药原因很多，一，最根本的原因是细菌生物的进化，实际上在没有抗生素之前, 细菌在自然界已经接触过抗生素，在这个过程中细菌为了生存产生耐药性，是必然的结果。 二，但是人为因素加速了细菌耐药性的产生，医院作为抗生素使用的一个主要地点，它的滥 用直接导致了细菌耐药性的上升。三，农畜牧业的大量应用抗生素、人口的流动和
3、旅游等因 素都是造成细菌耐药性上升的主要原因。现在的耐药性细菌主要出现在医院，属于院内感染， 但是院内感染的耐药菌有向社区蔓延的趋势，这也是我们现在进行细菌培养和药敏试验的一 个重要任务。二、中枢神经感染中枢神经感染是威胁生命的严重感染。中枢神经感染近年变化情况：原发性中枢神 经感染（尤其急性脑膜炎）的控制取得较大成绩；医院内相关中枢神经感染不断上升，如手术后感染。每年我院神经外科手术接近万台，脑脊液的细菌培养和药敏是诊断治疗中 枢神经系统感染的金标准。临床和微生物室之间需要进一步沟通配合（一）中枢神性系统常见病原体中枢神性系统常见病原体，一，急性细菌性脑膜炎：脑膜炎奈瑟菌、肺炎链球菌、无 乳
4、链球菌、单核李斯特菌、大肠埃希菌、肠杆菌科、梅毒螺旋体、流感嗜血杆菌、金黄色葡 萄球菌。二，慢性细菌性脑膜炎：结核分枝杆菌（主要）、布氏杆菌、弗朗西斯氏菌。三， 急性病毒性脑膜炎：柯萨奇病毒、肠道病毒、埃可病毒、脊髓灰质炎病毒、单纯疱疹病毒1 型，2型、水痘病毒、圣路易斯脑炎病毒、马萨诸萨病毒。四，脑脓肿：以厌氧菌为主， 链球菌、消化链球菌、消化球菌、类杆菌、金黄色葡萄球菌、肠杆菌科细菌、脑膜炎奈瑟菌、 肺炎链球菌、洋葱伯克霍德菌。五，脊髓和外周神经感染：脊髓灰质炎病毒、单纯疱疹病毒、 水痘病毒、HIV-1病毒、流感病毒、衣原体。六，硬膜外脓肿：金黄色葡萄球菌、大肠埃 希菌、铜绿假单胞菌、链球
5、菌、消化链球菌、奴卡菌、放线菌、真菌、分枝杆菌。七，开颅 手术后中枢神经感染：表皮葡萄球菌、鲍曼不动杆菌、凝固酶阴性葡萄球菌、铜绿假单胞菌、 金黄色葡萄球菌、肠球菌、念珠菌、肺炎克雷柏菌、大肠埃希菌、肠杆菌科细菌。（二）不同年龄急性脑膜炎常见的病原体急性脑膜炎的病原体在不同年龄里的分布情况。不同的年龄的急性脑膜炎，病原体明 显有区别。新生儿的急性脑膜炎以大肠埃希菌、无乳链球菌和单核李斯特菌为主。小于2 个月的儿童以无乳链球菌、单核李斯特菌、大肠埃希氏菌为主。10岁以下儿童以流感嗜血 杆菌、肺炎链球菌、脑膜炎奈瑟菌为主。青年以脑膜炎奈瑟菌为主。成人以肺炎链球菌和脑 膜炎奈瑟菌为主。老年人以肺炎链
6、球菌、革兰阴性杆菌和单核李斯特菌为主。（三）近年天坛医院脑脊液前10位细菌分离情况如下表格所示是近年天坛医院脑脊液前10位细菌分离情况。以条件致病菌为主， 第一位是表皮葡萄球菌，第二位是鲍曼不动杆菌。其他如铜绿假单胞、金黄色葡萄球菌也常 见。序号菌名菌株数百分比表皮葡萄球菌11415.6%2鲍曼不动杆菌8011.0%3人葡萄球菌628.5%4铜绿假单胞菌517.0%5金黄色葡萄球菌446.0%6耳葡萄球菌344.7%7洛菲不动杆菌344.7%8肠球菌314.3%9溶血葡萄球菌283.8%10肺炎克雷柏菌233.1%（三）2010年天坛医院鲍曼不动杆菌敏感率中枢神经感染是一个严重的感染，在中枢感
7、染里细菌的耐药情况直接威胁病人的生命。 天坛医院常见的中枢神经感染的细菌敏感性的统计（如图所示），结果发现，占在第二位的 鲍曼不动杆菌对常见的一些药物的的敏感率都不超过20%，耐药情况非常严重。（四）2010年天坛医院金黄色葡萄球菌敏感率金黄色葡萄球菌是传统的化脓性球菌，它的感染致命性较强，耐药情况也不容乐观。 如图所示金黄色葡萄球菌，MRSA占有率达到80%以上。从统计情况来看，万古霉素百分之百 的敏感，利奈唑胺效果也比较好。其它的抗生素的敏感率基本都低于20%。三、如何做好细菌检验所有的实验包括细菌检验，大体分为三个阶段，分析前、分析中、分析后，临床同实 验室紧密配合，才能获得好培养结果。
8、（一）细菌培养前的准备细菌培养前的准备，首先必须从选择试验项目、正确书写化验单开始，其次考虑的问 题是病人是否需要特殊的准备，有哪些干扰因素影响实验结果。二，要标本的采集、保存、 运送。在整个过程中，所有接触细菌培养标本的都是潜在的传染性物质或传染源，必须严格 按照生物安全要求进行操作。在整套管理体系中，实验室要建立标本的接受、质量评定和退 回制度。（二）细菌培养前医生的准备有效的结果从医生开单开始。作为一个医生，培养前一定要思考几个问题。首先病 原体做什么化验，用什么的方法能达到更好的目的，怎样留取标本，怎样保存标本，怎样运 送标本。（三）细菌检验标本留取的通用要求细菌检验标本留取的通用要求
9、。首先所有的细菌检验标本必须有严格的无菌观念，防 止污染。二，抗菌药物使用前留取标本。三，生物安全观念，防止发生实验室感染。四， 正确的选择使用容器和采样器材，容器的选择有几点基本要求：第一，密闭，有生物安全 的要求；其次不能含有抑制细菌生长的物质，比如用消毒液浸泡的容器。五，选择真正的 感染部位标本。六，标识标本采集时间，病人信息，采集部位等。四、脑脊液标本（一）脑脊液标本的釆集情况脑脊液一般通过腰椎穿刺术获得，特殊情况下可采用小脑延髓池或脑室穿刺术。腰椎 穿刺：消毒皮肤，L3-L4，L4-L5，或L5-S1之间穿刺，首先测颅压，然后缓慢抽取脑脊液，放入防渗漏无菌容器。一般收集于3只无菌试管
10、内，每管12ml,第一管作细 菌学检查，第二管作做化学和免疫学检查，第三管作细胞计数和分类，如怀疑为恶性肿瘤， 另留一管作脱落细胞学检查。常规细菌培养，真菌培养或分枝杆菌培养每项标本量不少于 2ml。标本收集后应立即送检，以免放置过久细菌溶解或形成凝块等影响检查结果。细菌培 养标本一般不用抗凝，遇高蛋白标本时可用SPS抗凝，其它抗凝剂影响细菌生长。（二）标本运送关于标本的运送。标本运送的最重要因素是时间，标本送检越及时越好，必须要在2 小时之内送到实验室。标本不能放入冰箱，因为脑脊液中有些细菌对温度敏感，影响细菌 培养。临床标本运送的环境条件越接近其在体内情况越好，必要时用运送培养基。按国家相
11、 关生物安全性要求将标本送到实验室。（三）标本拒收的判断标准临床实验室标本拒收的判断标准：标本量不能满足实验要求；容器破裂或其他可能 造成污染的情况。注：社区获得性急性脑膜炎一般少见真菌和分枝杆菌，由于其他部位血清 学或培养方法很快鉴定出真菌病原体（新型隐球菌，粗抱子菌，荚膜组织胞浆菌），故不鼓 励进行脑脊液真菌培养。脑脊液中结核分枝杆菌最好用PCR方法进行检测。（四）标本保存脑脊液培养标本病房不允许保存标本。原则上，实验室也不保存脑脊液细菌培养标 本。必要时用运送培养基或保存液短期保存细菌培养用脑脊液标本。用于抗原抗体检测或 核酸检测目的的脑脊液标本在-30 C冰箱冷冻保存五、如何看细菌报告
12、怎样看细菌培养的报告。首先看细菌报告时必须要了解一下实验室的报告方式和要求。 现在各级医院大量推行细菌报告的三级报告制度，以及细菌报告的规范用语。二，拿到一个 培养结果时，首先要看培养的结果与临床情况是否相符。三，如果细菌报告的感染菌与临床 相关，要考虑感染菌的来源。四，选择一个正确的治疗方案。（一）病原菌的报告的基本要求病原菌报告的基本要求。第一，根据阳性培养时间，对病原菌初始菌量进行评估。第 二,分级报告，电话报告初步结果。初步报告细菌鉴定结果，在细菌名称前加“可能”或“初步”。最终鉴定结果发生变化，提出更改声明。第三，假如细菌未鉴定到菌种，向医生 报告细菌属名，但注明“未能鉴定到种”。（
13、二）相同细菌的重复报告程序同部位细菌已做鉴定和药敏，不需再全面鉴定和药敏试验。可以根据初步的细菌鉴定 情况重复上一次的报告。重复试验的时间：一般原则，细菌形态学相同，7天后再进行鉴 定药敏;铜绿假单胞菌4天后重复药敏试验;万古霉素耐药肠球菌30天后重复药敏试验。 如果重复报告，报告时在细菌名称后注“参考XX日完成的培养鉴定或药敏试验结果”。重 复药敏试验，只记录结果，但不报告，除非与前面结果不同。（三）污染的评估污染的评估。评估平皿上的污染菌（特别当肉汤无菌生长时）。明确的污染菌不 要报告（如未生长在划线上的细菌）。怀疑污染菌时，报告要注：培养出XX细 菌，可能污染，建议再培养。怀疑“污染”的
14、霉菌或皮肤正常菌群，在重复分离时，应 考虑是否为病原体。（四）阴性报告关于阴性报告。根据标本的种类，确定多少天报告阴性结果，脑脊液培养5天报阴 性结果。报告：培养5天为阴性。假如报告后还进行培养，可在备注内注明：“培养 将继续观察X天”，但不再发报告，除非培养结果转为阳性。（五）危急结果报告对于有重要临床和流行病学意义的结果，及时电话报告相关人员。这些结果包括：从 正常无菌部位的标本（血，脑脊液，胸腹水，组织等）中分离出的任何细菌。重大临 床意义和流行病学相关病原体。对任何不常见和特殊的细菌，立即打电话给病房。（六）结果解释培养结果报告的重点：临床的重要性和 病人诊断和治疗的相关内容。微生物含
15、量低 时，决定致病性较困难。不要将正常菌群，混合培养或可能污染的培养详细报告，这样可能 导致错误的诊断和治疗。但如果直接革兰染色见到细菌，但培养时未培养出，需进一步用 其它方法检测，如DNA探针、特殊培养基、特殊染色、免疫学试验和其它培养条件。只有 分离菌有临床意义时，才进行药敏试验，有些药敏试验提供的信息并不总有效，如咽喉部分 离的化脓性链球菌对青霉性均敏感，药敏试验无指导意义。（七）细菌培养结果的局限性细菌培养是中枢神经感染诊断的金标准。但是也有很多的局限性，主要表现为两个方 面：假阴性和假阳性。造成假阴性和假阳的原因，首先细菌培养和鉴定药敏试验与检验者的 经验能力直接相关，实验室人员培训。假阴性主要的影响因素有，培养标本放置时间过长，培养条件不正确，培养基选择不 正确，标本量过少或有抑制细菌生长的物质存在于标本中。假阳性结果主要是由于污染，污染来源主要有两个方面,一是临床采取标本时，由于操作的不严格造成附近正常菌群的污染。另外一种是实验室操作时造成的污染。（八）看药敏试验报告时思考的问题当我们拿到一个药敏报告时，我们要思考几个问题。一，被检菌是否有临床意义。 二,正确选择试验药物，需要考虑病人的感染部位、病人情况、给药途径、首选药、 次选药、补充药。三，正确理解敏感、中介度和耐药的意义。（九）药敏结果的局
