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1、real-time-PCRTaqman 探针设 计、实时多重PCR 探针的选择、 引物的设计及评价作者:日期:real time PCRTaqman探针设计、实时多重PCR探针的选择、引物的设计及评价一、实时荧光Taqman探针设计总原则：探针选择要保守，引物选择要保守，因此必须找一段100-200bp相对要保守的片段来设计引物 与探针。即real-time PCR的扩增片段是50bp-150bp。当找不到150bp的保守片段时，必须确保 探针的片段是保守的。在设计探针和引物时，要同时考虑在两条链上设计引物与探针。但要注意的是：在那条链上设计探针时， 就应靠近在同一条链上设计的引物（即上游引物
2、）。这样，可保证在将来扩增时，即便没有完全扩增，也有 荧光信号报告出来。两者的距离最好是探针的5端离上游引物的3有一个碱基，但也可以重叠。若在原序列中找不到合适的探针与引物（1主要是探针和上游引物的距离太远，而离下游引物的距离却较近 时；2突变位点要求在探针的5端也能检测到荧光信号，但却是在3端），可在互补的序列中设计引物与 探针。另real-time PCR中的探针和引物的Tm值，均要高于平常PCR的引物和杂交的探针的Tm值。二、探针的设计探针设计的基本原则：1. 保守：探针要绝对的保守，有时分型就单独依靠探针来决定。理论上有一个碱基不配对，就可能检测 不出来。若找不到完全保守的片段，也只能
3、选取有一个碱基不同的片段。且这个不同的碱基最好在探针的 中间，对探针与目的片段的杂交影响不大，不相同的碱基最好不要在两端，因为两端不利于探针的杂交。 且最好为A或T，而不能为G或A，因为A、T为双键，而G、A为三键。2. 探针长度Taqman探针的长度最好在25-32bp之间，且Tm值在68-72C之间，最好为70C，确保探针的Tm 值要比引物的Tm值高出10C,这样可保证探针在煺火时先于引物与目的片段结合。因此探针最好是富含 GC的保守片段，保证其的Tm值较高。现在有Taqman MGB探针，在TAMER之后再标记一个MGB, 可使探针的Tm值较高，即使探针片段较短，也可达到Taqman探针
4、的Tm值要求(68-70C)。3. 探针的名称应标记探针在基因组的位置及长度。4. 探针Tm值计算用oligo或primer preiemer软件即可计算Tm值。确保探针中GC含量在30-80%。应避免探针中多个重复的碱基出现，尤其是要避免4个或超过4个的G碱基出现。5. 探针的评价用 DNAstar 软件中的 Primerselect 软件，点击“log菜单中的“create primer catalog”，在“name”中输入探针的名称、位置，按Tab键进入“sequence”，粘贴或输入要分析的探针序列。选中整个序列后, 在“report”菜单下“primer self dimer”,分
5、析探针的二聚体。弹出的窗口中就告诉此探针有多少个dime r，并对此探针用dG值进行评价(通常给出最差的dG值，理论上是dG值越大越好)。在“report”菜单下“p rimer hairpins”,分析探针的发夹结构。弹出的窗口中就告诉此探针有多少个hairpins，并对此探针的h air pins进行评价。多重荧光PCR时，要对多条探针进行“pai r dime r”进行分析。6. 探针的5端不能为G因为即使单个G碱基与FAM荧光报告基团相连时，G可以淬灭FAM基团所发 出的荧光信号，从而导致假阴性的出现。7. Taqman探针与引物之间的位置Taqman探针应靠近上游引物，即Taqman
6、探针应靠近与其在同一条链上的上游引物。两者的距离最好 是探针的5端离上游引物的3有一个碱基，但也可以重叠，要保证Taqman探针的5端离上游引物的5 端至少有4bp。女如 forward primer Taqman probe5 一 3 5 FAM 3染料NNNNNNN NNNNNNN发表序列：5-NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN-3互补发表序列 3-NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN-5NNNNNNN3 -5reverse primer或：reverse primer5 一 3NNNNNNN发表序列：5-NNNNNNNNN
7、NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN-3互补发表序列 3-NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN-5NNNNNNN NNNNNNN料染 3 - MAF5 35Taqman probe forward primerTaqman probe forward primer然后探针用同一染料标记，这样在实时PCR反应中，虽然是多重PCR反应，但报告却是同一个染料报告。三引物的设计1. 上下游引物要保守为了能够扩增出所需要的保守片段，必须对保守的100-200片段进行PCR扩增。所以引物的选取也要非 常的保守，最好不要有不同的碱基，若不得不有时，也必须保证引物
8、的3端至少有4个碱基是完全保守才 可。在设计保守引物时，要在发表序列上分别找保守一致的区域，即在发表序列的5端引物位置找的是3端至 少有5个bp保守，在即在发表序列的3端引物位置找的是5端至少有5个bp保守。5NNNNNNN 3发表序列：5-NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN-33NNNNNNNNN 52. 上下游引物的长度和Tm值上下游引物的长度一般为18-25bp之间，且Tm值在58-60C之间。确保引物中GC含量在30-80%。 应避免引物中多个重复的碱基出现，尤其是要避免4个或超过4个的G碱基出现。引物的3端最好不为G 或/和C。引物3端的5个碱基不应出
9、现2个G或/和Co上游引物应标记F（forword）,且在基因组的位置及长度；下游引物应标记R（reverse），且在基因组的位 置及长度。用oligo或primer preiemer软件即可计算Tm值。上下游引物的Tm值相差最好不超过2C, 长度相差最好不超过4bpo3. 引物的评价用 DNAstar 软件中的 Primerselect 软件，点击“log菜单中的“create primer catalog”，在“name”中输入引物的名称、位置，按Tab键进入“sequence”，粘贴或输入要分析的引物序列。选中整个序列后, 在“report”菜单下“primer self dimer”,
10、分析引物的二聚体。弹出的窗口中就告诉此引物有多少个dime r，并对此引物用dG值进行评价（通常给出最差的dG值，理论上是dG值越大越好）。在“report”菜单下“p rimer hairpins”,分析引物的发夹结构。弹出的窗口中就告诉此引物有多少个hairpins，并对此引物的h air pins进行评价。再选择所需要的上下游引物，在“r epo rt”菜单下“p rime r pai r dime rs”,分析上下游引 物的dimers。弹出的窗口中就告诉此对引物有多少个dimer，并对此对引物用dG值进行评价（通常给出 最差的dG值，理论上是dG值越大越好（dG值通常为负值），绝对值
11、超过4.5kcal/mol易导致产生引物 二聚体带，并且降低引物有效浓度而使PCR反应不能正常进行）。不必考虑引物与探针之间的配对与发夹 结构，因为探针的Tm值非常之高。4. 上下游引物与探针的距离（上下游引物的位置）理论上讲，上游引物的3端离探针的5端为1-20bp，最佳是1bp，最近为上游引物的3端离探针的3 端为4bp；下游引物要与探针有一定的距离，但要保证下游引物的3端离探针的3端最为15-150bp。整 个目的片段的长度最好在50-150bp之间，最长不超过200bpo5. 简并引物的设计当为了能够同时扩增即使在引物位点也有突变的目的片段，若多个碱基出现的概率相同，就要在此位点， 设
12、计一个代表多个碱基的简并子。在合成引物时，在合成到此位点时，就不是加入一个碱基，而是同时加 入简并子所代表的多个碱基。这样，实质合成的引物是多条引物，只不过是在简并子位置碱基不同而已。 但简并引物要考虑每条引物的Tm值，确保简并子所代表的不同碱基的不同引物Tm值相差不超过2C。 若超过2C,在确保引物的3端引物相同时，在Tm值较低的碱基引物的5端加入几个碱基，使其的Tm 值相同。但这时就不是简并引物，而是分别合成长度不同，简并子位点碱基不同，但Tm值相同的两条引 物，最后在进行等浓度的混合即可。5 一 3NNNANNNNNNGNNN序列：5-NNNNNNNNNA/GNNNNNNNNNNNNNN
13、NNNNNNNNNN-3RR四、实时多重PCR探针的选择：1多重实时PCR的多种含意有两种：一为选择保守的探针和引物，利用不同的染料标记探针，在检测时 可根据荧光的颜色来判定不同的产物。另一种为选择保守的引物，扩增不同长度的目的片段，反应中加入 SYBRN染料，最后根据不同目的片段的Tm值来判定不同的物品。2. 多重实时PCR的荧光探针应为同一类型：如同时为Taqman探针、或同时为MGB探针、或同时为B eacon探针。3. MGB探针的优点:a.MGB探针较短（14-20bp），更容易找到所有排序序列的较短片段的保守区。b.短片段探针（14-20bp）加上MGB后，Tm值将提高10C，更容
14、易达到荧光探针Tm值的要求。4. MGB探针的设计原则1）探针的5端避免出现G,即使探针水解为单个碱基，与报告基团相相连的G碱基仍可淬灭基团的荧光信 号。2）用primerexpress软件评价Tm值，Tm值应为65-67C。3）尽量缩短Taqman MGB探针，但探针长度不少于13bp。4）尽量避免出现重复的碱基，尤其是G碱基，应避免出现4个或4个以上的G重复出现。5）原则上MGB探针只要有一个碱基突变，MGB探针就会检测到（MGB探针将不会与目的片段杂交，不产 生荧光信号）。因此，在进行SNP检测时，为了检测到突变子，即Taqman MGB不与目的片段杂交，不 产生荧光信号，探针目的片段产
15、生荧光信号检测将探针的突变位点尽量放在中间1/3的地方。注意：为了 满足上述要求的4个条件，探针的突变位点可向3端移动，但突变位点至少在离3端 2个碱基的前方（即 必须确保探针的后两个碱基是绝对的保守），以进行SNP检测。反过来，若要进行同类检测，找的是保守 片段区，探针中不应有突变位点。若探针即便是只有13个bp,探针仍不完全保守。有几个突变，突变位点 也应靠近探针的5端，这样，即便是突变，探针也可与目的片段杂交，产生荧光信号。另一种方法是设计 简并探针，也可达到即使是突变，仍可检测到突变。5在多重PCR中，多重PCR的各个引物之间相互干扰和各个探针之间相互干扰分析设计好各对引物和探针后，重新在用DNAstar软件中的Primerselect软件，打开保守在同一文件中的多 重PCR的引物文件，然后两两分别选中所设计的多重引物或两两分别选中所设计的多重探针后，在“report”菜单下“primer paidimers”,分析上下游引物的dimers。弹出的窗口中就告诉此对引物有多少个dimer,并对此对引物用dG值进行评价（通常给出最差的dG值，理论上是dG值越大越好）。6多重实时荧光PCR扩增片段影响最好每重扩增相同长度的目的片段，但长度不以相差太大。7同
