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1、初识外泌体外泌体是 一类有细胞释放的细胞外囊泡。外泌体的特点见 正文。细胞外囊泡简称EV ,是由细胞释放的各种具有膜结构的 囊 泡 结 构 统 称 ，这 些 囊 泡 的 直 径 可 以 从 30 、 40nm 到 8、 9um 。细 胞外囊泡有不同的亚群，而目前研究最火热的是外泌体这个亚群。然而由于目前很难纯化到非常纯的外泌体亚群，人们纯化到的 通 常 是 直 径 小 于 200nm 的 囊 泡 ， 因 此 越 来 越 多 的 人 开 始 称 之 为sEV （即 small extracellular vesicle ，小细胞外囊泡）。为了严 谨，所以今天我们也以细胞外囊泡来称呼这些膜泡结构。
2、本文中没 有特殊说明的情况下，细胞外囊泡主要指外泌体和微囊泡。今天主要介绍内容包括细胞外囊泡的研究意义、细胞外囊泡的 分类、细胞外囊泡含有的成分、细胞培养上清的制备、细胞外囊泡 的保存、细胞外囊泡的鉴定实验要求。所有内容都参考目前已发表 的综述，并非 hzangs 杜撰。所以请新朋友们放心学习 。细胞外囊泡的研究意义目前，细胞外囊泡的功能还没有完全阐明。已有的报道认为它 们能够调节宿主-病原体的相互作用， 参与传染性和炎性疾、神经 疾病和癌症等很多种疾病的病理过程，同时在正常的生理过程中也 发挥着介导细胞间通讯的重要功能，已有文章报道细胞外囊泡在发 育中也发挥着重要作用。细胞外囊泡在临床医学中
3、也有十分光明的 应用前景，主 要是因为它们含有丰富的生物标志物，可用于监测临 床状态，治疗反应，疾病进展等，同时由于它们具有递送生物分子 的功能，因此它们还有发展成临床药物递送载体的潜力。细胞外囊泡的分类细胞外囊泡一这个词是由国际细胞外囊泡学会(ISEV )创造的 术语，根据细胞外囊泡的生物合成或释放途径可以对囊泡进行分类： 外 泌 体 ( exosomes ) 直 径 为 30-150nm ， 起 源 于 内 吞 途 径 ， 其 密 度约为 1.11-1.19g mL -1；微粒/微囊泡( microparticles/microvesicles ) 直 接 从 质 膜 释 放 ， 直 径
4、约 100-1000nm ；凋亡小体( apoptotic body/bleb ) 直径约为 50nm-2 pm ,由细胞凋亡产生；肿瘤小泡(large oncosomes )直 径约1-10 pm，由肿瘤细胞释放产生；以及其他各种EV亚群。由 于不同 EV 亚群的大小以及它们的所包含的生物分子存在差异， 因 此现在已经有几个小组开始表征 EV 亚群的组成。最近的论文声称， 基于一般表面蛋白质组学分析或个别 EV 群体的转录谱， 对细胞外 囊泡进行了成功的亚群分类。 目前可以通过差速离心、过滤、免疫 亲和、层析、流式细胞分选、密度梯度离心选取不同密度区域等多 种手段大致分离不同的细胞外囊泡亚群
5、， 但是这些方法都不能完全 纯化到特定的亚群，分离到的通常是富集了某一个亚群同时带有其 他细胞外囊泡亚群。细胞外泡含有的成分细胞外囊泡的组成成分并不是随机的，每一个细胞外囊泡都会 携 带 特 定 的 分 子 信 息 。 实 际 上 ， 这 些 纳 米 尺 寸 的 细 胞 外 囊 泡 能 够 携带蛋白质，脂质，核酸和糖等生物活性分子在细胞间传递信号， 并且其包装的独特分子构成决定了要传递给受体细胞的细胞外信 号的类型。有一个复杂的分选系统来决定那些分子能够进入细胞外 囊泡。细胞培养上清的制备目前有两个策略来制备细胞培养上清用于提取细胞外囊泡。使 用去除细胞外囊泡的胎牛血清（FBS ）培养基培养细
6、胞和使用不含 FBS 的培养基培养细胞（ 血清饥饿细胞）。但是目前一些高水平的 文章报道使用的方法通常是前者。另外，有些文章开始关注去除细 胞外囊泡的胎牛血清中游离 RNA 对实验结果的影响，但是目前并 没有形成共识。如 果需要先储存培养上清，一 定量后再用于细胞外 囊泡分离，那需要预先去除体系中的死细胞和细胞碎片。细胞外囊泡的保存L6rincz等人曾对中性粒细胞来源的细胞外囊泡做了不同条件 的储存，之后再去分析这些囊泡的特性，他们发现虽然细胞外囊泡 样品中囊泡数量和形态没有明显变化，但即使是储存在-20 或-80 摄氏度情况下的细胞外囊泡也存在磷酯酰丝氨酸外翻明显增多的 情况；但他们同时也发
7、现，尿液来源的细胞外囊泡并没有这些变化。 Kalra 等人分离了来自结直肠癌细胞的细胞外囊泡，不同条件保存 一定时间后进行 PKH67 染色跟踪细胞外囊泡的摄取，分析发现这些囊泡依旧可以被细胞摄取。就目前的情况，学 者们并未就储存条 件对细胞外囊泡是否有影响达成共识。因此建议大家实验时分离细 胞外囊泡后尽快用于实验，尽量减少储存过程。细胞外囊泡的鉴定及实验要求根 据 国 际 细 胞 外 囊 泡 协 会 于 2014 年发表的一个指导手册（MISEV ），鉴定 外泌体首先需要通过 WB 来鉴定细胞外囊泡的标 志蛋白是否存在于样品中，通过电子显微镜来观察样品中细胞外囊 泡的形态特征，通过 NTA 等手段来分 析样品中 细胞外囊泡的群体 特征（粒子浓度、直径分布等）。今天就先介绍到这里。细胞外囊泡领域作为生物学研究中的一 个新兴领域越来越受到学者和生物公司的关注，也有越来越多的研 究报道出现。但是我们也要清楚的认识到该领域的研究技术依旧不 完善，对 细胞外囊泡的认识依旧不充分，细 胞外囊泡研究依旧处于 一个起始阶段，要走的路还很长。希望今天的内容对大家有所帮助。
