《氨基酸测定》

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1、氨基酸测定1主题内容与适用范围本标准规定了用氨基酸自动分析仪测定食物中氨基酸的方法。本标准适用于食物中的天冬氨酸、苏氨酸、丝氨酸、谷氨酸、脯氨酸、甘氨 酸、丙氨酸、缬氨酸、蛋氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、组氨酸、 赖氨酸和精氨酸等十六种氨基酸的测定。其最低检出限为 10pmol。本标准不适用于蛋白质含量低的水果、蔬菜、饮料和淀粉类食物的氨基酸测 定。2原理食物蛋白质经盐酸水解成为游离氨基酸，经氨基酸分析仪的离子交换柱分离 后，与茚三酮溶液产生颜色反应，再通过分光光度计比色测定氨基酸含量。3试剂全部试剂除注明外均为分析纯，实验用水为去离子水。3.1浓盐酸：优级纯。3.2 6mol/L

2、盐酸：浓盐酸(3.1)与水1：1混合而成。3.3苯酚：须重蒸馏。3.4混合氨基酸标准液(仪器制造公司出售)：0.00250mol/L。3.5缓冲液3.5.1 pH2.2的柠檬酸钠缓冲液：称取19.6g柠檬酸钠(Na C H O2H O)和3657216.5mL浓盐酸加水稀释到1OOOmL,用浓盐酸或50%的氢氧化钠溶液调节pH至2.2。3.5.2 pH3.3的柠檬酸钠缓冲液：称取19.6g柠檬酸钠和12mL浓盐酸加水 稀释到1000mL，用浓盐酸或50%的氢氧化钠溶液调节pH至3.3。3.5.3 pH4.0的柠檬酸钠缓冲液：称取19.6g柠檬酸钠和9mL浓盐酸加水 稀释到1000mL，用浓盐酸

3、或50%的氢氧化钠溶液调节pH至4.0。3.5.4 pH6.4的柠檬酸钠缓冲液：称取19.6g柠檬酸钠和46.8g氯化钠(优 级纯)加水稀释到1000mL，用浓盐酸或50%的氢氧化钠溶液调节pH至6.4。3.6茚三酮溶液3.6.1 pH5.2的乙酸锂溶液：称取氢氧化锂(LiOHH O)168g，加入冰乙酸2(优级纯)279mL，加水稀释到1000mL，用浓盐酸或50%的氢氧化钠溶液调节pH 至 5.2。3.6.2茚三酮溶液：取150mL二甲基亚砜(CHOS)和乙酸锂溶液2 6(3.6.1)50mL加入4g水合茚三酮(C H OH 0)和0.12g还原茚三酮(C H O2H O) 一、人 、，9

4、432181062搅拌至完全溶解。3.7 高纯氮气：纯度99.99%。3.8冷冻剂：市售食盐与冰按1：3混合。4仪器和设备4.1真空泵。4.2恒温干燥箱。4.3水解管：耐压螺盖玻璃管或硬质玻璃管，体积2030mL。用去离子水 冲洗干净并烘干。4.4真空干燥器(温度可调节)。4.5氨基酸自动分析仪。5 样品处理 样品采集后用匀浆机打成匀浆(或者将样品尽量粉碎)于低温冰箱中冷冻保 存，分析用时将其解冻后使用。6 分析步骤6.1 称样准确称取一定量样品，精确到O.OOOlg。均匀性好的样品如奶粉等，使样品 蛋白质含量在1020mg范围内；均匀性差的样品如鲜肉等，为减少误差可适当 增大称样量，测定前再

5、稀释。将称好的样品放于水解管中。6.2 水解在水解管内加6mol/L盐酸(3.2)1015mL(视样品蛋白质含量而定),含水量 高的样品(如牛奶)可加入等体积的浓盐酸，加入新蒸馏的苯酚(3.3)34滴，再 将水解管放入冷冻剂中，冷冻35min，再接到真空泵的抽气管上，抽真空(接 近 0 psi) ，然后充入高纯氮气；再抽真空充氮气，重复三次后，在充氮气状态 下封口或拧紧螺丝盖将已封口的水解管放在110lC的恒温干燥箱内，水解22h 后，取出冷却。打开水解管，将水解液过滤后，用去离子水多次冲洗水解管，将水解液全部 转移到50mL容量瓶内用去离子水定容。吸取滤液1mL于5mL容量瓶内，用真空 干燥

6、器在4050C干燥，残留物用12mL水溶解，再干燥，反复进行两次，最 后蒸干，用1mL pH2.2的缓冲液(3.5. 1)溶解，供仪器测定用。7 测定准确吸取0.200mL混合氨基酸标准(3.4)，用pH2.2的缓冲液(3.5.1)稀释到 5mL，此标准稀释液浓度为5.00nmol/50p L，作为上机测定用的氨基酸标准，用 氨基酸自动分析仪以外标法测定样品测定液的氨基酸含量。8 计算式中：X样品氨基酸含量，g/100g；c样品测定液中氨基酸含量，nmol/50L； F样品稀释倍数；V水解后样品定容体积，mL；M氨基酸分子量；m样品质量，g;审一折目成馬霑升样品测宦液的氨基酸含址川品伽3109

7、将样品含量由ng折算成g的系数。注：样品氨基酸含量在1.00g/100g以下，保留两位有效数字；含量在 1.00g/100g以上，保留三位有效数字。十六种氨基酸分子量天冬氨酸： 133.1；苏氨酸： 119.1；丝氨酸： 105.1；谷氨酸： 147.1；脯氨酸： 115.1；甘氨酸：75.1；丙氨酸：89.1；缬氨酸：117.2；蛋氨酸：149.2；异亮氨酸：131.2；亮氨酸：131.2；酪氨酸：181.2；苯丙氨酸：165.2；组氨酸：155.2；赖氨酸：146.2；精氨酸：174.2。9 允许差同实验室平行测定或连续两次测定结果相对偏差绝对值W12%。10 其他10.1测定条件（以Be

8、ckman 6300型氨基酸自动分析仪为例） 缓冲液流量：20mL/h；茚三酮流量： 10mL/h；柱温：50、65 和 70C；色谱柱： 20cm；分析时间： 42min。10.2 标准出峰顺序和保留时间（图略）10.3 标准图谱（图略）附录A其他型号氨基酸自动分析仪特点（参考件）A1 测定条件HITACHI83550HITACHIL 8500缓冲液流量，mL/min0.2250.4茚三酮流量， mL/min0.30.3柱温，C5357色谱柱， mm4X1504.6X60分析时间， min5030最低检出限， pmol3010A2 标准出峰顺序和保留时间HITACHIHITACHI83550L 8500出峰顺序保留时间，min1 天冬氨酸9.885.902 苏氨酸10.866.563 丝氨酸11.887.224 谷氨酸13.528.155 脯氨酸14.348.866 甘氨酸18.3811.257 丙氨酸19.7712.088 缬氨酸22.9013.389 蛋氨酸24.6414.5810 异亮氨酸26.9716.7811 亮氨酸28.4117.8612 酪氨酸30.1418.8313 苯丙氨酸31.9019.6414 赖氨酸35.5421.9815 组氨酸40.1724.1616 精氨酸48.5328.20