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1、western blot常见问题汇编A. 对初学者看什么资料比较好？解答：抗体技术实验指南和Antibodies（a laboratory manual， wrote by Ed Harlow ，david lane）两本书不错。2. 针对样品的常见问题B. 做线粒体膜UCP2蛋白的Western Blot （以下简写成Western Blot），提取线粒体后冻存（未加蛋白酶抑制剂），用的博士德的一抗，开始还有点痕迹，现在越来越差，上样量已加到120g，换了个santa cloz的一抗仍不行。是什么原因？蛋白酶抑制剂单加PMSF行吗？解答：怀疑是样品问题，可能是：1，样品不能反复冻融；2，样品
2、未加蛋白酶抑制剂。同时，建议检查Western Blot过程， 提高一抗浓度。对于加蛋白酶抑制剂来说，一般加PMSF就可以了，最好能多加几中种蛋白酶抑制剂。C.细胞水平要做western blot，多少细胞提的蛋白够做western blot？ 解答：一般5106就足够了D.同一样品能同时提RNA又提蛋白么？这样对western blot有无影响？ 解答：能，没有问题，我们做过。E. 同一蛋白样品能同时进行两种因子的Western Blot检测吗？解答：当然可以，有的甚至可以同时测几十种样品。F. 如果目标蛋白是膜蛋白或是胞浆蛋白，操作需要注意什么？解答：如果是膜蛋白和胞浆蛋白，所用的去垢剂就
3、要温和得多，这时最好加上NaF去抑制磷酸化酶的活性。G. 我的样品的蛋白含量很低，每微升不到1微克，但是在转膜时经常会发现只有一部分蛋白转到了膜上，就是在转膜后染胶发现有的孔所有的蛋白条带都在，只是颜色变淡了，有什么办法可以解决？解答：你可以加大上样量，没有问题，还有转移时你可以用减少电流延长时间，多加510甲醇。 H. 想分离的蛋白是分子量260kd的，SDS-PAGE电泳的分离胶浓度多大合适？积层胶的浓度又该用多少？这么大分子量的蛋白容易作Western Blot吗？解答：260kd的蛋白不好做， 分离胶用6， Stacking Gel 3.5。I. 如果上样量超载，要用什么方法来增加上样
4、量？如果需要加大上样量使原来弱的条带能看清楚。解答：可以浓缩样品，也可以根据你的目标分子量透析掉一部分小分子蛋白。一般地，超载30是不会有问题的。如果已经超了不少了，而且小分子量的也要，可以考虑加大胶的厚度，可以试试1.5mm的 comb。J. 蛋白变性后可以存放多久？解答：80，一两年没有问题。最关键两条：不要被蛋白酶水解掉；不要被细菌消化掉(也是被酶水解了)。K. 我所测定的蛋白分子量是105KD，按理说分离胶应当采用7.5%，但我所查资料却要求分离胶和浓缩胶均采用11的配方，不知为何？解答：上述您提到的两种凝胶均可以使用，因为105的蛋白在上述两种胶的线性分辨范围内，但需注意条带位置。L
5、. 接下来我准备采用DAB显色技术，二抗是生物素化的多克隆克隆抗体，三抗是亲和素生物素体系，不知采用这样的方案后，封闭液是否要作调整，能否再用5的脱脂奶粉呢？好像有资料说脱脂奶粉会影响亲和素生物素的生成，是吗？ 解答：不能使用脱脂奶粉，因为脱脂奶粉中含生物素，用代替应该好一点M. 还有一问题，一般一次上样的蛋白总量是多少，跟目的蛋白的表达量有关系吗？解答：Western Blot一般上样30100微克不等，结果跟目的蛋白的丰度、上样量、一二抗的量和抚育时间都有关系，也与显色时间长短有关。开始摸条件时，为了拿到阳性结果，各个步骤都可以量多一点时间长一点，当然背景也就出来了。要拿到好的结果，如果抗
6、体好的话比较容易，抗体不好的话就需要反复地试了，当然有的不适合Western Blot的怎样做也不行。所以拿到好的结果不容易。N. 做组织样品的western的时候，处理样品有什么诀窍吗？还有，您用过大牛血清做封闭剂吗？浓度如何？效果是不是比BSA好一点？解答：必须进行研磨、匀浆、超声处理，蛋白质溶解度会更好，离心要充分，膜蛋白需用更剧 烈的方法抽提，低丰度膜蛋白可能还要分步抽提(超速离心)。还有一点就是组织中的蛋白酶活性更强，需要注意抑制蛋白酶的活性（加入和蛋白酶抑制剂cocktail），封闭剂一般5%脱脂奶粉较常用。如果一抗为多克隆克隆抗体，使用也是不错的选择。O. 您是否可以介绍一下大分
7、子量蛋白200KD，在做western要注意什么呢？解答：做200kd蛋白的Western Blot时要注意，分离胶最好选择7%的；剥胶时要小心；转移时间需要相应延长；要做分子量参照（否则出现杂带不知道如何分析）。P. 有什么方法可以提高上样量？解答：可以浓缩样品；增大上样体积来增大上样量。Q. 我要检测的目的蛋白是分子量大概为42kd的膜蛋白，膜蛋白提取可不可以不用到超速离心机，有没有直接用低温高速离心机就可以的提到膜蛋白的方法，42kd的蛋白分子量算不算大？解答：如是需要提取膜蛋白，（而不是只需要提取膜蛋白），可以用Ripa buffer提取膜蛋白和胞浆蛋白，用这个做Western Blo
8、t就可以了。如果是非要只提取膜蛋白就要用到超速离心机。42kd 不算大，也不算小，所以，可以按照一般的转移方法实施。R. 蛋白的上样量有没有什么具体的要求？解答：上样量要根据实验的要求来定， 如果要求是定量和半定量的Western Blot 则上样量要均等， 如果只是要定性，则没有太大的关系， 尽量多上就行了， 但是不要超过0.3g/mm2。S. 一抗，二抗的比例是否重要？解答：比较重要，调整好一抗，二抗的比例，可以去掉部分非特异的本底。 3. 抗体T. 做细胞信号传导，要做磷酸化某因子Western Blot，其二抗有何要求？解答：对二抗无要求，要看你实验条件来选择，一般推荐用HRP标记的二
9、抗。U. 同一公司的另外抗体用这个稀释度做出来效果很好，所以没做预试，怕费时间，用什么样的稀释度比较好呢？我用的ELL+plus试剂盒显色。转膜过夜，一抗孵育也是过夜的，若封闭也过夜的话就要四天才看的到结果了。解答：不同抗体，即使是同一公司的抗体，其最佳的抗体稀释度也是不一样的，需要你实验摸索。我觉得转膜过夜好像没有必要吧，转膜的目的也就是将蛋白转到膜上就行啦，何必浪费时间呢。至于具体的转膜时间，还要看你的目的蛋白分子量的大小；转膜的设备，是半干式，还是湿式。一抗当然可以过夜，如果你想所短Western Blot时间的话，可以增高一抗的孵育温度，我们实验室一般37度，两小时就足够了；你可以参照
10、抗体说明书。至于一抗和二抗得稀释度，你可以一抗1：1500；二抗1：20000试试。另外建议你洗膜时，多洗几次，最好是在封闭；一抗和二抗后至少是5x5min，跑一张好膜不容易，多尽点心吧，这样不会浪费你的时间，只会节省你的时间！V. 免疫组化和Western Blot可以用同一种抗体吗？解答：免疫组化时抗体识别的是未经变性处理的抗原决定簇（又称表位），有些表位是线性的，而有的属于构象型；线性表位不受蛋白变性的影响，天然蛋白和煮后的蛋白都含有；构象型表位由于受蛋白空间结构限制，煮后变性会消失。如果你所用的抗体识别的是蛋白上连续的几个氨基酸，也就是线性表位，那么这种抗体可同时用于免疫组化和West
11、ern，而如果抗体识别构象形表位，则只能用于免疫组化。一般抗体说明书上都有注明此种抗体识别的氨基酸区间。（限于单抗）W. Western Blot 中抗体的重复应用问题解答：抗体工作溶液一般不主张储存反复使用，但是如抗体比较珍贵，可反复使用23次。稀释后应在23天内使用，4度保存，避免反复冻融。4. 滤纸、胶和膜的问题X. NC膜 PVDF膜 尼龙膜怎样鉴别？解答：尼龙膜是较理想的核酸固相支持物，有多种类型；硝酸纤维素膜是目前应用最广的一种固相支持物，价格最便宜；PVDF膜介于二者之间。就结合能力而言：尼龙膜结合DNA和RNA能力可达480600g/cm2，可结合短至10bp的核酸片段；硝酸纤
12、维素膜结合DNA和RNA能力可达80100g/cm2，对于200bp的核酸片段结合能力不强；PVDF膜结合DNA和RNA能力可达125300g/cm2。就温度适应性而言：尼龙膜经烘烤或紫外线照射后，核酸中的部分嘧啶碱基可与膜上的正电荷结合；硝酸纤维素膜依靠疏水性相互作用结合DNA，结合不牢固；PVDF膜结合牢固，耐高温，特别适合于蛋白印迹。就韧性而言：尼龙膜较强；硝酸纤维素膜较脆，易破碎；PVDF膜较强。就重复性而言：尼龙膜可反复用于分子杂交，杂交后，探针分子可经碱变性被洗脱下来；硝酸纤维素膜不能重复使用；PVDF膜可以重复使用。Y. 在做Western Blot时，PBDF膜用甲醇浸泡的目的
13、？解答：PVDF膜用甲醇泡的目的是为了活化PVDF膜上面的正电基团，使它更容易跟带负电的蛋白质结合，做小分子的蛋白转移时多加甲醇也是这个目的。Z. 检测磷酸化的JNK 和非磷酸化的JNK可以在同一张膜上吗？解答：可以。AA. 转膜后经丽春红染色的条带，为什么大蛋白分子的一端（即点样空的一侧）的转膜好象不是很好，为什么？解答：这是正常的，大分子的蛋白转移的慢， 你延长转移时间和电流，大分子一端就会好的多，但是小分子的就有可能会变淡。BB. 我想问您裂解细胞用三去污裂解法，还是用上样缓冲液？解答：用上样缓冲液，这样有几个好处，可以提取总蛋白，同时又可以让磷酸化酶失活。CC. 采用tank syst
14、em有什么讲究？解答：建议低电压，长时间，（一般tank System 用衡压好点），如 28V 1416hrs。DD. 做HSP WESTEN定量，同样的抗体免疫组化能做出，而WESTEN却不能？解答：这多半是抗体的问题，要看抗体的说明，是否能做Western Blot和IHC。EE. 膜一般要如何处理？解答：一般用甲醇泡泡就可以了。FF. 如果是68转印膜，要加多少一抗？解答：一抗的稀释度是有说明的，根据你的一抗看看就知道了，但是那么大的膜孵育体积一般最少为35ml。 GG. 上下槽缓冲液有何要求，怎样才能达到最佳效果。解答：无要求。HH. 跑电泳的时候配的胶总是“缩”是什么原因呢？是有的
15、成分不对吗？解答：没什么问题，就是你胶里的水分被蒸发了。过夜时拿保鲜膜包起来，在里面加点水保持湿度就可以了。如果过夜，胶里的水分被蒸发，采用保鲜膜包上也可以；也可能母液（30%聚丙酰胺）有问题，你可以重新配制一份观察；能够替换的试剂，尽量换一下，选用好的试剂，避免找问题麻烦。脱色液中甲醇的含量太高也会造成胶缩。II. 膜、滤纸、胶大小有何讲究？解答：如果是用的是半干转，顺序为：阴极滤纸胶膜滤纸。滤纸的长宽分别比胶小12mm，而膜的长宽分别比胶大12mm。绝对禁忌：上下两层滤纸因为过大而相互接触，这样会短路，电流不会通过胶和滤纸。JJ. 蛋白质的分子量跨度很大，如要分离小21KD，中至66KD，大至170KD，可以一次做好吗？解答：这么广的分布不好转移，一般建议：21kd和66kd可以一起转，12SDS-PAge， 湿转36V ， 35hrs就可以了， 可以根据你实验室的经验调节；170kd 用7%SDSpage， 48V 10hrs16hrs。KK. 不能很好地将大分子量蛋白转移到膜上， 转移效率低怎么样解决？解答：可以考虑：转移缓冲液中加入20%甲醇（是指终浓度）(优化的转移缓冲液，可以参考蛋白质技术手册)，因为甲醇可降低蛋白质洗脱效率，但可增加蛋白质和NC膜的结合能力，甲醇可以防止凝胶变形，甲醇对高分子量蛋白质可延长转移时间；转移缓冲液
