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1、综合性实验方案土壤中产淀粉酶芽孢杆菌的筛选及淀粉酶活力的测定 一、摘要 本实验通过从土壤中分离出能产淀粉酶的芽孢杆菌并对其进行鉴定、保存，实验中波及菌株的分离纯化、菌株的形态学鉴定和生理生化鉴定，根据伯杰氏细菌手册鉴定其中的种属。 实验中通过80水浴20min预解决,杀死无芽孢菌体，筛选出芽孢杆菌;再用稀释涂布平板法对芽孢杆菌进行初步筛选；又通过度区划线对初筛选菌株进一步分离纯化；然后再用选择性淀粉培养基进行筛选,得到纯培养的产淀粉酶，以及产芽孢的杆菌,最后通过对产淀粉酶芽孢杆菌做有关的生理生化实验,将筛选出来的菌株进行鉴别,鉴别到了地衣芽孢杆菌和环状芽孢杆菌。 核心词：芽孢杆菌 淀粉酶 酶活
2、测定二、实验目的规定1、 理解微生物分离纯化的原理及微生物分离纯化常用的措施和技术；2、 掌握从土壤中筛选产淀粉酶菌株的原理及措施;3、 掌握微生物的摇瓶培养措施及淀粉酶活力测定的原理及措施；4、 培养学生自行设计实验方案流程、综合分析解决问题及判断实验成果的能力;5、 对所学习过的微生物实验措施井陉综合技能训练；6、 从不同环境土壤样品中筛选出能产淀粉酶的芽孢杆菌，并分析比较多种淀粉酶菌株的产淀粉酶活力及总结各芽孢杆菌在土壤中的分布状况;三、实验原理 土壤是微生物生活的大本营，它所含微生物无论是数量还是种类都是极其丰富的。因此，土壤是微生物多样性的重要场合,是发掘微生物资源的重要基地，可以从
3、中分离、纯化得到许多有价值的菌株。 从混杂微生物群体中获得只具有某一种或某一株微生物的过程称为微生物分离与纯化。平板分离法普遍用于微生物的分离与纯化。其基本原理是选择适合与待分离微生物的生长条件,如营养成分、酸碱度、温度和氧等规定,或加入某种克制剂导致只利于该微生物生长,而克制其她微生物生长的环境，从而裁减某些不需要的微生物。 微生物在固体培养基上生长形成的单个菌落,一般是由有一种细胞繁殖而成的集合体。因此可通过挑取单菌落而获得一种纯培养。获取单个菌落的措施可通过稀释涂布平板法或平板划线等技术完毕。值得指出的是,从微生物群体中经分离生长在平板上的单的菌落并不一定保证是纯培养。因此,纯培养的拟定
4、除观测其菌落特性外,还要结合显微镜检测个体形态特性后才干拟定，有些微生物的纯培养要通过一系列分离与纯化过程和多种特性鉴定才干得到。 芽孢杆菌是土壤细菌中最具活力的部分之一，也是土壤细菌的重要种群之一。芽孢杆菌属实一类好氧或兼性厌氧、产生抗逆性内生孢子的杆状细菌。多数为腐生菌，重要分布于土壤、动植物体表及水体中。由于芽孢杆菌属的细菌可以产生多种有用代谢产物，芽孢又是菌体度过不良环境的休眠体,因此，在工、农业生产商有较高的应用价值。四、 实验材料与措施1、 实验材料1.1土样的采集选用广大理南前面、广大生化楼前小河附近两处的土壤,五点法采集，边长5cm。铲去表层土,去0c深土壤，每一种土样约200
5、左右（每个点40g)。将土样放入无菌的纸袋中，并记录采集的时间、地点、植被类型,冰箱中保存备用。分别记做土样、B土样。.2培养基淀粉筛选培养基淀粉2g，蛋白胨 g，NaC 2. g,琼脂 ，自来水1000 ml,H自然。斜面种子培养基牛肉膏3 ，蛋白胨1, 2. g,琼脂1015 g,自来水10 ml，H 7.27.4。蛋白胨液体培养基(做吲哚实验用）蛋白胨1 g,NaC g,自来水1000 ml,H 7.27.，121灭菌20i。葡萄糖蛋白胨培养基(VP和MR实验用)蛋白胨 g，葡萄糖5 g，NaCl5，自来水00ml，pH.27.4,121灭菌20 min。糖发酵培养基（做糖酵解实验用:葡
6、萄糖、阿拉伯糖、木糖、甘露醇)蛋白胨2 g，NaC5g,HO 0.2g,1%溴麝香草酚蓝水溶液3，待试糖10g(一般糖或醇按1%量加入,而乳糖，半乳糖按1.5%的量加入）,自来水1000l，p.74，21灭菌20mi。络氨酸平板（做络氨酸水解实验用)：L络氨酸.5,悬浮于0ml蒸馏水中,11,20min灭菌；B：称取3.3g营养琼脂，蒸馏水10ml,121,20min灭菌；然后将A液倒入融化至温热的10ml无菌的营养琼脂中，混合,即成络氨酸水解平板。络素平板(做络素水解实验用）A:取5脱脂奶粉加入50m蒸馏水中,110,15min灭菌B:另称.5g琼脂溶于5m蒸馏水中,12,20min灭菌。待
7、冷至550时，将两液混匀倒平板，即成牛奶平板。将平板倒置过夜，使表面水分干燥;硝酸盐培养基硝酸钾0.2g、蛋白5g、蒸馏水 00mL、H7.、硝酸盐还原试剂甲液：将对氨基苯磺酸0.8g溶解于2.5o/，乙酸溶液100L中。乙液:将甲萘胺0.5g溶解于2.ml/L乙酸溶液100m中。制法（溶解,校正pH，分装试管,每管约5m，2高压灭菌1min。)西蒙斯氏柠檬酸盐培养液（做柠檬酸盐运用实验用）柠檬酸钠2g，NCl 5 ,MgSO4.H2 2g,K2HpO4.2O 1g,(NH4)2HPO，1%溴麝香草酚蓝水溶液1ml,琼脂15-0,自来水100ml，pH70,21灭菌20 min。淀粉牛肉膏蛋白
8、胨琼脂培养基可溶性淀粉2，牛肉膏3，蛋白胨10，NaCl 5g，琼脂12g,蒸馏水100ml,pH 7.4。(%、5%、7%、10%）高盐培养基（做耐盐实验用）牛肉膏 g，蛋白胨1 g,Nal（2g,g，g,10g）,琼脂05 g,蒸馏水000 ml，pH 7.2.4。明胶培养基（做明胶液化实验用)牛肉膏3 g,蛋白胨10 ，明胶1，蒸馏水100 ml,p7.0半固体培养基(做运动性实验用)琼脂含量05%,其她组分比例按牛肉膏蛋白胨培养基配制。pH5.7肉汤蛋白胨g，牛肉膏3,a5,蒸馏水100ml,pH70.00%溶菌酶实验蛋白胨10g，牛肉膏g,NCl 5g,蒸馏水1000m,pH2-.4
9、卵黄实验组分一：33营养琼脂，1%葡萄糖，蒸馏水1000组分二：5ml无菌生理盐水，5m卵黄(移液枪无菌注射器吸取)，混匀向50保温的组分一中加入组分二5l，混匀，倒平板,过夜备用13试剂耐盐性实验：Na粉末糖酵解实验:葡萄糖、阿拉伯糖、木糖、甘露醇。革兰氏染色:草酸铵结晶紫染色液、卢戈氏碘液、95%乙醇，0.5沙黄染色液；芽孢染色：%孔雀绿染色液，.5%石碳酸复红。单染色:草酸铵结晶紫或石炭酸复红。V实验(M实验)0NH溶液,a-萘酚吲哚实验：乙醚、吲哚试剂碘原液：碘g,碘化钾g,加水定容至50ml硝酸盐实验:甲液（对氨基苯硫酸0ml/L醋酸100m； 乙液(a-萘胺0+ 5mol/醋酸10
10、l）；酪素水解:脱脂奶粉(牛奶）；酪氨酸水解：L酪氨酸溶菌酶抗性实验:溶菌酶卵黄反映:新鲜鸡蛋硝酸盐实验:硝酸盐明胶液化实验：明胶柠檬酸盐运用实验:西蒙斯氏柠檬酸盐淀粉酶活力测定:1 3,5-二硝基水杨酸试剂1.3.2仪器; 无菌培养皿,接种环，土样，三角瓶,烧杯，试管，酒精灯，无菌吸管，载玻片，吸水纸，涂布器,显微镜，移液管,移液枪等。恒温摇床,恒温培养箱,高压蒸汽灭菌锅，超净工作台，恒温水浴箱，磁力搅拌器等。 2、实验措施 . 土壤样品悬液制备 2.1.1土壤悬液制备各称取2g 土壤样品于装有200l 无菌水的400ml 锥形瓶中,加入玻璃珠与土壤悬液一起振荡，制成土壤悬液。置于1沸水1m
11、n，以杀死非芽孢杆菌。静置5mi.2.12 土壤悬液稀释吸取上清液1m 加到具有 ml 无菌水的试管中，配成10 g的土壤悬液，并进一步稀释至13 /ml、10 gm ，共三个浓度梯度。2.2 分离纯化2.2.1 芽孢杆菌属的纯培养涂布分离:分别吸取不同稀释度的土壤悬液0.1ml于牛肉膏蛋白胨平板上,用无菌玻璃涂棒涂布均匀。每个稀释度2个反复,3倒置培养24。划线接种：每个土样挑5个形态特性不同的单菌落。(一种平板一种细菌,并且分好区)，挑取一种菌株，先在平板培养基的一边作第一次平行划线3-4条,再转动培养皿约60角，并将接种环上剩余物烧掉,待冷却后通过第一次划线部分作第二次平行划线,再用同样
12、的措施通过第二次平行划线部分作第三次平行线和通过第三次平行划线部分作第四次平行划线。划线完毕，盖上皿盖，倒置37倒置培养2h,再继续分区划线23次，以获取较纯的菌种。(判断纯不纯的措施是:通过革兰氏染色观测，措施在下面；还要通过芽孢染色拟定纯菌种为芽孢杆菌，两个实验都通过后,在进行菌种的保存,措施在下面）2.2.经单染色镜检直至得到纯菌种挑取上述划线所培养的部分菌种出来进行革兰氏染色镜检，若发现视野内浮现形态、大小、颜色一致且为杆状的菌体,则将其相应的菌种划线接种到新的营养琼脂平板上，标记,37倒置培养24h，否则继续进行划线分离,培养后再经革兰氏染色镜检直至得到纯种杆菌。染色环节涂片、干燥、
13、固定;染色:在涂有菌种的载玻片上滴加草酸铵结晶紫或石碳酸复红盖住有菌的部分，染色,12mn，倾去染液,用水冲洗直至无染色液为止。镜检：用油镜观测;单菌落:菌落的形状、颜色、质地、透明度一致、菌体形态为直杆状,长度均一、宽度一致，并能产生芽孢时,确觉得芽孢杆菌属的纯培养物。.2.3芽孢染色分离芽孢杆菌（2h菌种)挑取已纯化的菌种,进行芽孢染色，拟定菌株为芽孢杆菌,拟定后。将纯化得到的单菌落分为两部分,其中一部分接种到培养基内,用以保存菌种，另一部分用来做其她实验。染色环节涂布、干燥及固定；初染:于涂片上加入2-3滴%孔雀绿水溶液,加热,用试管夹夹住载玻片在火焰上用微火加热,边加热边滴加染色液,自
14、载玻片上浮现蒸汽时,开始计时,约4min；脱色:倾去染液,待玻片冷却后，水洗至孔雀绿不再褪色为止；复染:滴加沙黄染色液，染2-3n,水洗；镜检：用油镜观测染色成果。芽孢呈绿色，菌体呈红色。2.24 产淀粉霉菌株的筛选淀粉水解实验挑取颜色、质地不同的单菌落，划线接种于可溶性淀粉培养基中,每种菌株做2个平板，将接种完毕得平板置于37恒温箱中倒置培养24h。取一种平板,立即加碘液,立即观测记录与否有透明圈浮现。将有透明圈的菌株做好标记。2.2.斜面保存菌种取多种无菌斜面试管数支,将有透明圈的菌株（用平行的培养基里面的菌种）接种到斜面，贴上标签,其距试管口2-3处。每种要菌接3管，加塞、包扎好到3倒置培养24h。2.3 初步鉴定23.1 形态学鉴定 将所得的斜面菌种接种到新的平板上培养以观测筛选出产淀粉酶芽孢杆菌菌落的大小、颜色、干湿状况、形
