实验8 毛细管电泳仪分离测定苯甲酸、山梨酸

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1、毛细管电泳仪分离测定苯甲酸、山梨酸【摘要】电泳是带电粒子在电场作用下在缓冲溶液中作定向运动的现象，毛细管电泳的电泳过程在散热效率极高的毛 细管内进行，故能够引入高的电场强度，从而全面改善分离质量。实验通过毛细管电泳法分离含苯甲酸和山梨酸 的未知样品，用归一化法测定含量。【关键词】 毛细管电泳 电渗 归一化法 苯甲酸 山梨酸【实验目的】1、了解毛细管电泳分离的基本原理；2、了解毛细管电泳仪（以安捷伦 7100 为例）的结构及基本操作；3、掌握毛细管电泳的基本定性、外标法、标准曲线定量方法。【基本原理】 原理概述：本实验通过使用毛细管电泳法，通过绘制工作曲线，分离测定未知样品中的苯甲酸和山梨酸。

2、电泳和电渗：电泳：带电粒子在电场作用下在缓冲溶液中作定向运动的现象；分为：自由电泳、区带电泳（将样品加于载 体上，并加一个电场，在电场作用下，得到良好的分离）等。电渗：液体相对于带电的管壁移动的现象。由于毛细管材料通常为熔融硅胶，其中的硅醇基团，是构成氢键 吸附并使毛细管内电介质产生电渗流的重要原因。在常用缓冲液pH值下，毛细管壁带负电，于是在贴 近管壁的液体表面形成了一个和管壁电荷异号的偶电层。在毛细管电泳中，电渗是指高电场作用下， 偶电层中水和阳离子或质子引起流体朝负极方向运动。电渗是毛细管电泳中最重要和最有趣的性质之 一。 粒子的运动速度：由于同时存在着泳流和渗流，粒子在毛细管电介质中的

3、运动速度应当是这两种速度的矢量 和，其迁移速率是电泳和电渗力的函数：正离子：运动方向和电渗一致，应当最先流出；中性离子：泳流速度为0，将随电渗而行；负离子：因其运动方向和电渗相反，在电渗速度大于电泳速度时，它将在中性离子之后流出图 1 不同粒子在毛细管电介质中的运动 毛细管电泳：特点：它的电泳过程在散热效率极高的毛细管内进行，故能够引入高的电场强度，从而全面改善分离质量。优点：使用细柱子，一是减小电流，因此减少自热；二是增大散热面积（侧面积与截面积之比），加快散热 缺点：进样和检测等技术方面的麻烦与困难。检测：电泳毛细管的直径极小，产生的溶质谱带体积也极小。通常采用的检测方法是电泳的柱上检测。

4、此时 峰宽对迁移时间将有一定的依赖性。移动较快的组分通过检测窗所需的时间较短，反之则较长。毛细 管电泳的紫外检测属柱上检测，检测点靠近管子的末端。毛细管的外壁通常有一层几微米的聚酰亚胺 涂层。使用时需要将一小段管子（小于1cm）的聚酰亚胺涂层去掉，以形成观察池。 所用样品简介：苯甲酸钠：苯甲酸的钠盐，无味或略带安息香气味，在空气中稳定，易溶于水，由于比苯甲酸更易溶于水， 比苯甲酸更常用与工业生产。但有研究显示，苯甲酸类具有叠加毒性作用，普遍已改用山梨酸盐 作为防腐剂。山梨酸：它是一种食品添加剂，对酵母、霉菌等许多真菌都具有抑制作用。通常用用于动物饲料、化妆品、 药品、包装材料和橡胶助剂等 定量

5、方法： 归一化法：把所有出峰的组分含量之和按100%的定量计算方法，当样品中所有组分均能流出色谱柱，并在检测器上都能产生信号的样品，可用归一化法定量，其中组分i的质量分数按如下公式计算：fAW 二 i i X100%i 工f Aii式中Ai为组分i的峰面积，fi为组分i的质量（或摩尔、体积）校正因子。优点：简便、准确，特别是在进样量不容易控制时，进样量以及流速、柱温等测定条件对定量结果影响很小 缺点：校正因子测定很麻烦。【仪器与试剂】1、仪器： Agilent 71000 型液相色谱仪；2、试剂:1.0 mol/L NaOH溶液；20 mmol/L PH=9.3硼酸钠溶液；待测样品；O.lmo

6、l/L苯甲酸溶液；O.lmol/L山梨酸溶液。【实验步骤】1. 样品制备:将待测样品倒入烧杯后放在超声波仪中超声脱气，去除溶液中溶解的空气等。脱气后的待测样品溶液通 过.45“m的滤膜过滤后，转移至进样瓶中备用。称量O.lg的苯甲酸样品，用超纯水加热溶解于100ml的容量瓶中，再从中移取5mL溶液至50ml容量管 中定容。称量0.1g的山梨酸样品，用超纯水加热溶解于100ml的容量瓶中，再从中移取5mL溶液至50ml容量管 中定容。2. 仪器的前期准备:打开计算机，等计算机启动完毕后，打开毛细管电泳仪电源开关。通讯完毕后，分别在进样盘中放入相应的 溶液: 1、 NaOH 溶液； 2、纯水； 3

7、、纯水； 4、 5、 6、缓冲液（硼酸钠）； 7、空； 8、废液,； 10、未知样品溶液 11、苯甲酸的标准溶液； 12、山梨酸的标准溶液。CE 平衡步骤:第一步，纯水冲洗5分钟。点击相应图标，设定inlet为2号位置，outlet为8号位置，冲洗（flush） 300 秒。第二步，缓冲液冲洗 5 分钟。操作同上，设定 inlet 为 6 号位置， outlet 为 8 号位置，冲洗 300 秒。3. 毛细管电泳仪相关参数:在 method 对话窗口中，进行相应的仪器参数的设定4、样品检测：设定检测方法： 第一步：冲洗毛细管柱（从 6 号瓶（缓冲液）到 8 号瓶（废液）冲洗 5 分钟）。 CE

8、 ConditioningFlush inlet 6 Vial, outlet 8 Vial for 5 minutes第二步：进样方式（对目标位置的样品加 50 mbar 的压力 4 秒）。CE InjectionInject by pressure,50 mbar,4 seconds 第三步：加检测电压（0.2 分钟后加相应的电压开始分离检测）。TimetableChange voltage 0.2 minutes,（选择参数）kV分别使用 15 kV 、20kV、25kV 的电压对进样盘 10 位置处的未知样品溶液进行 3 次分离检测（在 Runcontrol/sampleinfo 中输

9、入需测试的样品位置号和相应的文件名，执行测试方法），观察电压不同对样品分离的影响，记录色谱图并记录保留时间及峰面积。选择在 20kV 电压的条件下，对进样盘中 11 位置（苯甲酸溶液）、12 位置（山梨酸溶液）进行测定，记 录他们在此参数下的保留时间。5. 关机 用纯水冲毛细管约半小时，观察基线平稳后，可在工作站上关闭电泳仪及检测器，然后关闭工作站，再依次 关闭仪器电源及计算机电源。数据处理与实验结果分析】1、15、20、25kV 电压下未知样的测定Peak MigTime Type Width Area Height Area# min min mAU*s mAU %1 4.387 BB2

10、8.819 BB3 9.775 BB0.0901 394.66327 74.09940 59.09120.0714 123.65283 26.03524 18.51400.0721 149.57249 32.26855 22.3948图 3 15kV 电压下未知样的测量结果mAU70605040302010Bsoo1min图 4 15kV 电压下未知样的出峰图像Peak MigTime Type Width Area Height Area# min min mAU*s mAU %1 3.193 BB2 6.376 BB3 7.056 BB0.0690 293.86929 70.01421 5

11、9.50760.0556 90.13195 24.12758 18.25140.0556 109.83371 30.81096 22.2410图 5 20kV 电压下未知样的测量结果DAD1 A. Sig二220,4 Ref=360,100 (STUDENT20180413000002.D)mAU605040302010图 6 20kV 电压下未知样的出峰图像1 2.456 BB2 4.S77 BB3 5.389 BBPeak MigTime Type Width Area Height Area# min min mAU*s mAU %0.0549 229.33788 65.46185 59

12、.80620.0494 69.48573 21.66430 18.12030.0477 84.64447 27.66366 22.0734图 7 25kV 电压下未知样的测量结果DAD1 A, Sig二220,4 Ref=360,100 (STUDENT20180413000003.D)mi门11- u o o o o o A 6 5 4 3 2 m图 8 25kV 电压下未知样的出峰图像由出峰图像和测量结果可以看出：同样的样品，其毛细管电泳的保留时间随电压增大而减小，峰宽和峰高也随之减小。从原理上可以得到解释电泳是带电粒子在电场力作用下，以不同的速度向电荷相反方向迁移的现象。而电压增大，带电

13、粒子受到的库仑力增大，故运动速度加快，所以保留时间减少，峰的大小也会变小；但电压对样品中各组分的峰面积占比不会有影响，这是显然的，因为未知样已经确定，其组分含量也不会有 变化，电压通常不会对其组分有影响。三次测量各个峰的面积占比如下表所示15kV测量20kV测量25kV测量平均值峰159.091259.507659.806259.4683峰218.514018.251418.120318.2952峰322.394822.241022.073422.2364表 1 未知样各个峰面积占比2、20kV 电压下苯甲酸和山梨酸标准样品的测定图 9 20kV 电压下苯甲酸的出峰图像DAD1 A. Sig=

14、220,4 Ref=360!100 (STUDENT.2OHflO413000005.D)mAU2D-15-1D-D56min图 10 20kV 电压下山梨酸的出峰图像由苯甲酸和山梨酸的出峰图像可知：苯甲酸在20kV下的保留时间为7.066min,山梨酸在20kV电压下的保留时间为6.388min。而20kV电压下未知样三个峰的保留时间分别为：3.193min、6.376min、7.056min。经过对比可得：未知样的第二个峰对应山梨酸，第三个峰对应苯甲酸。通过与苯甲酸和山梨酸标准样品的比较可以证明未知样中含有苯甲酸和山梨酸。3、未知样中苯甲酸、山梨酸含量计算由 1,2 步骤可以得到：未知样的第一个峰面积占比 59.4683% ，其为未知物，未知样中的第二个峰面积占比18.2952%，其为山梨酸，未知样中的第三个峰面积占比22.2364%，其为苯甲酸。未知物、苯甲酸、山梨酸的校正因子分别为：1.000、0.262、0.224，苯甲酸通过归一化公式可以计算出：未知样中苯甲酸的百分含量：x 100% = 8.40%x 100% = 5.91%0.262 x 22.23641.000 x 59.4683 + 0.262 x 22.2364 + 0.224 x 18.2952未知样中山梨酸的百分含