《PCR的定义、历史与运用》由会员分享，可在线阅读，更多相关《PCR的定义、历史与运用（14页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、n 更多资料请请访问.(.)更多企业学学院：./SShopp/中小企业业管理全全能版183套讲讲座+8897000份资料./Shhop/40.shttml总经理、高高层管理理49套讲座座+1663888份资料./Shhop/38.shttml中层管理理学院46套讲座座+60020份份资料./Shhop/39.shttml国学智慧慧、易经经46套讲座座./Shhop/41.shttml人力资源源学院56套讲座座+2771233份资料./Shhop/44.shttml各阶段员员工培训训学院77套讲座座+ 3324份份资料./Shhop/49.shttml员工管理理企业学学院67套讲座座+ 8872
2、00份资料./Shhop/42.shttml工厂生产产管理学学院52套讲座座+ 1139220份资料./Shhop/43.shttml财务管理理学院53套讲座座+ 1179445份资料./Shhop/45.shttml销售经理理学院56套讲座座+ 1143550份资料./Shhop/46.shttml销售人员员培训学学院72套讲座座+ 448799份资料./Shhop/47.shttml何谓PCRR 简简单的说说，PCCR就是是利用DDNA聚聚合酶对对特定基基因做体体外或试试管内(InnViitroo)的的大量合合成。基基本上它它是利用用DNAA聚合酶酶进行专专一性的的连锁复复制.目目前常用用
3、的技术术,可以以将一段段基因复复制为原原来的一一百亿至至一千亿亿倍。 PCCR的要要素 基本的的PCRR须具备备.要要被复制制的DNNA模板板(TTempplatte).界界定复制制范围两两端的引引物(PPrimmerss).DDNA聚聚合酶(Taaq.Pollymeearsse)4.合成的的原料及及水。PPCR反反应包括括三个主主要步骤，分分别是 1).Deenatturaatioon2).Annneaalinngoofpprimmerss,aand3).Exxtennsioonoofpprimmerss。所所谓DDenaaturringg乃是将将DNAA加热变变性，将双股股的DNNA加热热
4、后转为为单股DDNA以以做为复复制的模模板.而Annneaalinng则则是令Priimerrs于一一定的温温度下附附着于模模板DNNA两端端。最最后在DDNA聚聚合酶(e.g.Taqq-poolymmeraase)的作作用下进进行引物物的延长长(EExteensiionofpriimerrs)及及另一股股的合成成。PCR的历历史 PCCR的发发展可以以说是从从DNAA合成酵酵素的发发现缘起起。DNNA合成成酵素最最早于119555年发现现(DDNApollymeerasseII),而较具具有实验验价值及及可得性性的 KKlennowfraagmeentofE.Cooli则是于于70年年代的初
5、初期由DDr.H.Kleenoww所发发现,但由于于这个酵酵素是一一种易被被热所破破坏之酵酵素,因此不不符合一一连串的的高温连连锁反应应所需。现现今所使使用的酵酵素(简称Taqqpoolymmeraase),则则是于119766年从热热泉HHotsprringg中的细细菌(TTherrmussAqquatticuus)分离出出来的。它的特特性就在在于能耐耐高温，是是一个很很理想的的酵素，但但它被广广泛运用用则于880年代代之后。PPCR的的原始雏雏形概念念是类似似基因修修复复制制(DDNAreppairrreepliicattionn)，它它是于119711年由Dr.KjjelllKllepp
6、pe提提出。他他发表第第一个单单纯且短短暂性基基因复制制(类类似PCCR前两两个周期期反应)的实实验。而现今今所发展展出来的的PCRR则于119833由DDr.KarryBB.MMulllis发发展出的的，Drr.MMulllis当当年服务务于一家家物科技技研究公公司(Perrkinn- EElmeerCCetuusCCorpporaatioon).目前前这家公公司在PPCR的的相关仪仪器及原原料上占占有很大大的巿场场。Drr.Muulliis并并于19985年年与SSaikki等等人正式式表了第第一篇相相关的论论文。此此后，PPCR的的运用一一日千里里，相关关的论文文发表质质量可以以说是令令
7、众多其其它研究究方法难难望其项项背。在在19989年，SScieencee将PPCR中中的DNNA合成成酵素命命名为当当年的风风云分子子(MMoleeculleoofttheyeaar)，而而PCRR本身则则列为年年度的重重要科学学发明产产物。当当然，它它的原发发明者更更在往后后获得诺诺贝尔的的桂冠。 影响PCR的因素 PCR是非常直接、简单又具有强大威力的技术。诚如一位当年参与PCR诞生的资深研究员HenryErlich所言”在分子生物学的领域中，只要拥有它，你便可以无照营业” (PCRallowspeopletopracticemolecularbiologywithoutaliscenc
8、e)。也因此，活用及慎用PCR是确保一定品质的必要条件。PCR本身虽然是一个单纯的实验技术，但是一个好的PCR反应及其产物则是受到很多因素的影响。这些因素色括反应中各种原料的浓度(Taq.Polymerase,primers,dNTPs,MgCl2)，也包括整个反应中各步骤的温度与时间的设定。当然DNA模板(Template)与引信(Primers)本身条件也占有一定的重要性。近来的观念中，共溶剂诸如Dimethylsulfoxide(DSMO)、glycerol、 ForamideandTetramethylammoniumchloride(TMAC)也对整个反应产生若干重要的影响。 PCR
9、的运用 PCR除了是一个诊断工具外，更重要的是它有广泛的运用。PCR本身可直接用来鉴定特定基因的存在与否，也可以用来侦测基因是否有异常(Genemutation,deletion,andrearrangement)。例如，在医学上对遗传疾病或肿瘤癌症的诊断及预后的评估；对细菌、病毒及霉菌感染的诊断。它也可成为一个生产线进而大量复制特定的基因进行基因密码的读取(DNAsequencing)及其它的运用。举凡对生物标本及法医学上的样本鉴定，从单一毛发、一只精虫或一滴血液、唾液来找出凶手。也可以做DNA指纹(Fingerprints)比对帮助亲子关系的鉴定。PCR更可以用于器官移植组织兼容性HLA的
10、分析。另外在演化上的分析，经由PCR的运用也产生重大的进展。近来，在生物医学的研究上，特别是细胞间讯息的传递分子，诸如介白质(Interleukines)及各种生长因子(Growthfactors)基因的表现都可用 PCR来进行质与量的分析。 PCR污染及解决对策PCR检测微量感染因子时，一定要注意产物残留污染的问题。 一污染的预防 进行PCR操作时，操作人员应该严格遵守一些操作规程，最大程度地降低可能出现的PCR污染或杜绝污染的出现。 （一）划分操作区：目前，普通PCR尚不能做到单人单管，实现完全闭管操作，但无论是否能够达到单人单管，均要求实验操作在三个不同的区域内进行，PCR的前处理和后处
11、理要在不同的隔离区内进行： 1.标本处理区，包括扩增摸板的制备； 2.PCR扩增区，包括反应液的配制和PCR扩增； 3.产物分析区，凝胶电泳分析，产物拍照及重组克隆的制备。 各工作区要有一定的隔离，操作器材专用，要有一定的方向性。如：标本制备PCR扩增产物分析产物处理。 切记：产物分析区的产物及器材不要拿到其他两个工作区。（二）分装装试剂：PCRR扩增所所需要的的试剂均均应在装装有紫外外灯的超超净工作作台或负负压工作作台配制制和分装装。所有有的加样样器和吸吸头需固固定放于于其中，不不能用来来吸取扩扩增后的的DNAA和其他他来源的的DNAA： 11PPCR用用水应为为高压的的双蒸水水； 22引引
12、物和ddNTPP用高压压的双蒸蒸水在无无PCRR扩增产产物区配配制； 3引物和和dNTTP应分分装储存存，分装装时应标标明时间间，以备备发生污污染时查查找原因因。 (三)实验操操作注意意事项尽管管扩增序序列的残残留污染染大部分分是假阳阳性反应应的原因因，样品品间的交交叉污染染也是原原因之一一。因此此，不仅仅要在进进行扩增增反应是是谨慎认认真，在在样品的的收集、抽抽提和扩扩增的所所有环节节都应该该注意： 1.戴一一次性手手套，若若不小心心溅上反反应液，立立即更换换手套； 2.使用用一次性性吸头，严严禁与PPCR 产物分分析室的的吸头混混用，吸吸头不要要长时间间暴露于于空气中中，避免免气溶胶胶的污
13、染染； 33.避避免反应应液飞溅溅，打开开反应管管时为避避免此种种情况，开开盖前稍稍离心收收集液体体于管底底。若不不小心溅溅到手套套或桌面面上，应应立刻更更换手套套并用稀稀酸擦拭拭桌面； 4.操作作多份样样品时，制制备反应应混合液液，先将将dNTTP、缓缓冲液、引引物和酶酶混合好好，然后后分装，这这样即可可以减少少操作，避避免污染染，又可可以增加加反应的的精确度度； 55.最最后加入入反应模模板，加加入后盖盖紧反应应管； 6.操作时时设立阴阴阳性对对照和空空白对照照，即可可验证PPCR反反应的可可靠性，又又可以协协助判断断扩增系系统的可可信性； 7.尽可可能用可可替换或或可高压压处理的的加样器
14、器，由于于加样器器最容易易受产物物气溶胶胶或标本本DNAA的污染染，最好好使用可可替换或或高压处处理的加加样器。如如没有这这种特殊殊的加样样器，至至少PCCR操作作过程中中加样器器应该专专用，不不能交叉叉使用，尤尤其是PPCR产产物分析析所用加加样器不不能拿到到其它两两个区； 8.重复复实验，验验证结果果，慎下下结论。 二追踪污污染源 如果不不慎发生生污染情情况，应应从下面面几条出出发，逐逐一分析析，排除除污染。 （一）设设立阴阳阳性对照照：有利利于监测测反应体体系各成成分的污污染情况况。选择择阳性对对照时，应应选择扩扩增弱，且且重复性性好的样样品，因因强阳性性对照可可产生大大量不必必要的扩扩增序列列，反而而可能成成为潜在在的污染染源。如如果以含含靶序列列的重组组质粒为为对照，1100个个拷贝之之内的靶靶序列就就足以产产生阳性性扩增。阴阴性对照照的选择择亦要慎慎重，因因为PCCR敏感感性极高高，可以以从其它它方法（SSourrtheern印迹或或点杂交交等）检检测阴性性的标本本中检测测出极微微量的靶靶分子。此此外，每每次扩增增均应包包括PCCR体系系中各试试剂的时时机对照照，即包包括PCCR反应应所需的的全部成成分，而而不加模模板DNNA，这这对监测测试剂中中PCRR
