基因工程大题共26

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1、2基因工程操作的基本步骤是什么？ 施工材料的准备，即目的基因、载体、工 具酶和受体细胞（宿主）的准备。用限制性内 切酶分别将外源 DNA 和载体分子切开。（切） 目的基因与载体 DNA 的体外重组，形成 重组DNA分子。（接）把重组的DNA分 子引入受体细胞，并建立起无性繁殖系。 （转 和扩 筛选出所需要的无性繁殖系，并保证 外源基因在受体细胞中稳定遗传、正确表达。（检）3如何理解基因工程的两个特点？ 答：基因工程的两个基本特点是分子水平的操 作和细胞水平的表达。分子水平的操作包括DNA 分离、切割和连接（还有其他一些 DNA 的修饰等） 。由于体外重组 DNA 的最终目的是 要改变生物的遗传

2、性， 所以分子水平的操作和 细胞水平的表达是基因工程的两个最基本的 特点。4基因克隆是如何使含有单个基因的 DNA 片段 得到纯化的？答：大分子质量的 DNA 会含有许多特殊限制性 内切核酸酶的限制位点，因此用一种限制 酶 处理一完整染色体或整个基因组会产生许多 不同的 DNA 片段，每一个片段带有基因组的一个不同的基因或一个不同的小片段。 当全部片 段与用同种限制酶处理过的载体分子混合时（如图所示） ，每个片段将插入一个不同的载 体分子 （ 如一个质粒 ） 。同样地， 当用这些质粒 转化宿主细胞时， 每个宿主细胞将只接收一个 质粒 DNA 分子，而筛选出的含重组质粒的每个 菌落实际上会含有某

3、一特异的供体 DNA 片段 的多个拷贝。 一旦带有待研究的特定基因的克 隆被确认了，此重组DNA分子可从宿主细胞中 提取出来进行纯化。 5比较遗传工程、基因工程和生物技术。 答：遗传工程是遗传学和工程学相结合的一门 技术科学。 借用工程技术上的设计思想， 在离 体条件下， 对生物细胞、细胞器、染色体或 DNA 分子进行按图施工的遗传操作， 以求定向地改 造生物的遗传性。 遗传工程的概念有广义和狭 义之分。 狭义的遗传工程就是指基因工程。 基 因工程（ gene engineering ）又称基因操作（ gene manipulation ）、重组 DNA（ recombinant DNA ）。

4、基因工程是以分子遗 传学理论为基础， 以分子生物学和微生物学的 现代方法手段，将不同来源的基因 （DNA 分 子） ，按预先设计的蓝图， 在体外构建杂种 DNA 分子， 然后导入活细胞， 以改变生物原有的遗 页第 #种酶失活，再加第二种酶，否则，易产生星号外来的 DNA 在相应的碱基上没有被甲基化， 宿第 2 页传特性，获得新品种，生产新产品，或是研究 基因的结构和功能。生物技术又称生物工艺 学，生物工程学。是根据生物学、化学和工程 学的原理进行工业规模的经营和开发微生物、 动植物细胞及其亚细胞组分， 进而利用生物体 所具有的功能元件 ( 如基因、蛋白质 ) 等来提供 商品或社会服务的一门综合

5、性科学技术。 它包 括基因工程、细胞工程、酶工程和发酵工程等。6说明San ger DNA测序法的原理。答：San ger DNA测序法建立在两个基本原理 之上：核酸是依赖于模板在聚合酶的作用下 由5端向3端聚合；可延伸的引物必须能 提供游离的 3羟基末端，双脱氧核苷酸由于 缺少游离的 3羟基末端，因此会终止聚合反 应的进行。 如果分别用四种双脱氧核苷酸终止 反应，则会获得四组长度不同的DNA片段。通 过比较所有 DNA 片段的长度可以得知核苷酸 的序列。11当两种限制性内切核酸酶的作用条件不同 时，若要进行双酶切， 应采取什么措施 ? 为什 么?答：注意星号活性；先低盐，后高盐；先低温 酶，

6、后高温酶； 并且可以直接在换酶前将第一活性，或使用通用缓冲液。12何谓限制性物理图谱？ 答：限制性物理图谱即限制性内切核酸酶作图 (restriction mapping) 。简单地说就是 DNA 分子中限制性内切核酸酶切割位点的定位， 即 DNA 分子中各种不同限制性内切核酸酶的酶 切位点的线性排列图。 标明限制酶在 DNA 分子 上的限制性位点的数目、 限制性片段大小及其 线性排列的顺序。13什么是细菌的限制修饰系统(Restriction ModificationSystem ， R-M system)?答：细菌中有作用于同一 DNA 的两种酶， 即分 解DNA的限制酶和改变DNA碱基结

7、构使其免 遭限制酶分解的修饰酶。 而且，这两种酶作用 于同一 DNA 的相同部位， 把这两种酶所组成的 系统称为限制与修饰系统。14细菌的限制修饰系统有什么意义 ?答：不同种的细菌或不同的细菌菌株具有不同 的限制酶和修饰酶组成的限制与修饰系统。 修 饰的本质是通过甲基化酶将 DNA 中某些碱基 进行甲基化修饰，由于宿主自身DNA上的这些 位点进行了修饰， 限制酶就不能进行切割。 而 主的限制酶通过对该位点的识别来分辨敌我， 并将入侵的外来 DNA 分子降解掉。所以 DNA 限制作用和修饰作用为细胞提供了保护。 15说明限制性内切核酸酶的命名原则要点。 答：基本原则：属名 +种名 +株名十序号。

8、首字母：取属名的第一个字母，且斜体大写。 第二个字母： 取种名的第一个字母， 斜体小写。 第三个字母： 取种名的第二个字母， 斜体小写。 第四个字母： 若有株名， 株名则作为第四个字 母，用正体。顺序号：若在同一菌株中分离 了几种限制酶，则按先后顺序冠以 I 、II 、III 等，用正体。所有的限制酶，前面还应带有 系统的名称 , 如限制性核酸内切酶 R. Hind III。修饰酶则在前面加上甲基转移酶 M,如甲 基转移酶 M. Hind III 。在上下文已清楚只涉 及限制酶的地方， R 可被省去。 16何谓限制性内切核酸酶的切割频率 ? 答：切割频率是指限制性内切核酸酶在某 DNA 分子中

9、预测的切点数。由于DNA是由四种类型 的单核苷酸组成，假定DNA的碱基组成是均一 的，而限制性内切核酸酶的识别位点是随机分 布的，那么对于任何一种限制酶的切割频率， 理论上应为 14n， n 表示该限制酶识别的碱 基数。 如识别 4 个碱基的限制酶， 其切割频率 应为每 256 个碱基有一个识别序列和切点( 1 44 = 1 256)，识别5 个碱基的限制性内 切核酸酶，其切割频率应为每 1024 个碱基有 一个识别序列和切点，余类推。18双酶消化法( double digest )绘制限制性 内切核酸酶酶谱的原理是什么 ? 答：双酶消化法是绘制 DNA 中两个或两个以上 限制性内切核酸酶图谱

10、所采用的方法。 做法是 在两个限制性内切核酸酶分别单独消化 DNA 分子的基础上， 再用这两个酶同时或先后消化 DNA根据它们的结果构建物理图谱。 17什么是限制性内切核酸酶的星号活性？受 哪些因素的影响 ?答： II 类限制酶虽然识别和切割的序列都具 有特异性，但是这种特异性受特定条件的限 制，即在一定环境条件下表现出来的特异性。 条件发生改变， 限制酶的特异性就会松动， 识 别的序列和切割都有一些改变。 改变后的活性 通常称第二活性， 而将这种因条件的改变会出 现第二活性的酶的右上角加一个星号表示， 因 此第二活性又称为星号活性。 诱发星号活性的 因素有如下几种：高甘油含量(5%，v/ v

11、):限制性内切核酸酶用量过高( 100U/ gDNA);低离子强度(v 25mmo/L);高 页pH（8. 0以上）：含有有机溶剂，如 DMSO 乙醇等；有非Mg2啲二价阳离子存在（如 Mn2+ Cu2+、Co2+、Zn2+等）。19什么是 DNA多态性（DNA polymorphism）? 答：在正常人群中， 各个体 DNA 分子的某些位 点可以发生中性改变，这些改变虽然会使 DNA 一级结构产生一定变化，但不影响基因的表 达，如果这种中性突变在人群中的频率不低于1 ，这一现象被称为多态性。DNA 多态性本质上是染色体 DNA 中核苷酸数目或排列顺序 的个体差异， 这些差异多数为中性突变，

12、不引 起表型改变。20什么是限制性片段长度多态性（restriction fragment lengt hpolymorphism ， RFLP）？答：当DNA序列的差异发生在限制性内切核酸 酶的识别位点时，或当DNA片段的插入、缺失 或 重复导致基因组 DNA 经限制性内切核酸酶酶 解后，其片段长度的改变可以经凝胶电泳区分 时，DNA态性就可应用限制性内切核酸酶进 行分析，这种多态性称为限制性片段长度多态 性 （RFLP） 。22何为回文序列？答：回文序歹U（ palindromic sequenee）是一 段自我互补的序列， 即同其互补链一样的序列（两者的阅读方向都是从5宀3,）。根据回

13、文序列的结构可分为： 完全的回文序列、 不完 全的回文序列和间断的回文序列。 完全回文序 列（如GAATTC，通常是限制性内切核酸酶的 识别序列；不完全的回文序（TACCTCCAT,CGTGAT，常是其他蛋白质的 结合位点 （如阻抑蛋白 ） ，在基因表达调控中有 重要作用；间断的回文序列（如GGTTXXXAACC 有一段是颠倒的重复） ，它可使单链的核苷酸 有可能在 tRNA 中所见到的一样，形成发夹环 的结构。23DNA连接酶的连接机理是什么？ 答：DNA连接酶是利用ATP或NAD+烟酰胺腺 嘌呤二核苷酸 （氧化型 ） 提供的能量催化 DNA 双链间的缺口形成磷酸二酯键。在连接反应 中，首先

14、ATP（NAD+）与DNA连接酶反应，同连 接酶生成一种共价结合的酶 -AMP 复合物。其 中AMP腺苷一磷酸）通过一种磷酸酰胺键同 DNA连接酶的赖氨酸残基的 -氨基相连。同 时释放出焦磷酸或烟酰胺单核苷酸（NMN）。并转移到磷酸基团上，形成DNA腺苷一磷酸复 第 4 页AMP激活DNA 一条链的5-末端磷酸基团， 合物。最后， 3-OH 对激活的磷原子作亲核 攻击，形成磷酸二酯键，同时释放出 AMP连 接反应是由在形成酶 - 腺苷酸复合体时，焦磷 酸水解和释放提供的能量驱动下进行的。 在以 ATP乍为能源的连接酶中，一个磷酸二酯键的 形成消耗掉两个高能磷酸键。 29列举质粒载体必须具有的基

15、本条件。 答： (1) 能独立复制； (2) 具有选择标记； (3) 有独特的酶切位点； (4) 能转化但不扩散。 24DNA 连接酶的作用特点有哪些？ 连接反应需要在一条 DNA 链的 3末端具有 一个游离的 -OH, 而另一条 DNA 链的 5 末端 具有一个磷酸基团 (-P) 的情况下， 才能发挥其 连接 DNA 分子的功能作用， 而在末端带有 5- 羟基和 3-羟基； 5-磷酸和 3-二脱氧核苷 基团的两个DNA片段之间不起连接作用。 连接反应中需要 ATP或NAD+和Mg2+为辅助 因子和激活因子； DNA连接酶不能够连接 两条单链的 DNA 分子，被连接的 DNA 链必须是 双螺旋

16、的一部分。 DNA连接酶只封闭双螺 旋 DNA 骨架上的缺口 (Nick) ，即在双链 DNA 的某一条链上两个相邻核苷酸之间失去一个 磷酸二酯键所出现的单链断裂， 而不能封闭双 链DNA的某一条链上失去一个或数个核苷酸所形成的裂口25影响DNA连接酶连接反应的因素主要有哪 些？答：1)反应温度：最佳反应温度37 C，但黏 性末端之间退火形成的氢键结合不稳定， 连接 黏性末端的最佳温度，一般认为 420 C比较 合适。 2) DNA 片段末端：不仅要考虑反应体 系中 DNA 末端的总浓度， 还要考虑载体与插入 片段的末端浓度的比例。原则上应保证一个DNA 分子的末端有较高的几率与另一 DNA 分 子连接，减少同一个分子两个末端之间的自身 连接。载体与插入片段 3 ： 1 1 ： 3。 3