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1、无菌操作的具体流程清洗与灭菌一、实验目的能独立地进行用于细胞培养的各种器皿的清洗与消毒，掌握干热灭菌法、湿热灭菌法和滤过 除菌法的操作，了解化学消毒法的使用方法。二、实验原理清洗与消毒是组织培养实验的第一步，是组织培养中工作量最大，也是最基本的步骤。体外 培养细胞所使用的各种玻璃或塑料器皿对清洁和无菌的要求程度很高。细胞养不好与清洗不彻底 有很大关系。清洗后的玻璃器皿，不仅要求干净透明，无油迹，而且不能残留任何物质。如有毒 的化学物质，哪怕残留01个，也可能影响细胞生长。灭菌手段的选择十分重要，对不同的物品 需采用不同的灭菌方法。假如选用的方法不对，即使达到了无菌却使被灭菌药品丧失了营养价值、
2、 生物学特性或其他使用价值也不行。以下在每种灭菌步骤中都介绍其使用范围。三、实验材料、用品材料：无臭氧型紫外灯，微孔滤膜(直径25)：孔径为0. 22p m,微孔滤膜(直径90)：孔径为0. 22M m,过滤器(直径25)。药品： 70或75酒精， 0. 1新洁尔灭，煤酚皂溶液(来苏儿水) ， 0. 5过氧乙酸，乳酸， 37 甲醛，高锰酸钾，NaOH，盐酸，重铬酸钾，浓硫酸(工业)，DEPC水体积分数0.1%的焦炭酸二 乙酉旨(diethylpyroearbonate)。仪器：超净台，干燥箱，高压锅，过滤器，过滤泵。四、实验步骤(一)清洗1. 新玻璃器皿的清洗先用自来水刷洗，再浸泡5%稀盐酸以
3、中和玻璃表面的碱性物质和其他有害 物质。2. 使用过的玻璃器皿的清洗(1) 使用过的培养用品应立即浸入清水，避免干涸难洗。(2) 用洗涤剂清洗玻璃器皿，自来水清洗数遍，倒置自然干燥。(3) 浸酸性洗液过夜。(4) 从酸性洗液捞出后自来水冲洗10.15次去除残余酸液，蒸馏水涮洗3次，倒置烘干。(5) 包装(牛皮纸或一般纸)。高压(15磅20 min)或干热(170C2 h)灭菌。(7)贮存备用。3. 胶塞的处理(1) 新胶塞应先用清水清洗之后再用0. 2%NaOH煮沸lO-20 min。(2) 自来水清洗10次。(3) 再用1%稀盐酸浸泡30 min。(4) 自来水清洗10次，蒸馏水涮洗3次。晾
4、干，高压灭菌(见(二)消毒与灭菌)。旧胶塞不必用酸 碱处理可直接用洗涤剂煮沸和清洗数次，过蒸馏水，晾干，包装并高压灭菌后，便可使用。(二)消毒1. 物理消毒法(1) 紫外线消毒用于消毒空气、操作台面和一些不能用干热、湿热灭菌的培养器皿，如塑料培养 皿、培养板等。这是常使用的消毒方法之一。(2) 干热灭菌 主要用于玻璃器皿的灭菌。将用于细胞培养的器皿放人干燥箱内，加热至160C， 保温90-120 min。用于RNA提取实验的用品则需180C，保温5-8 h。（3）湿热灭菌 此方法也称为高压蒸汽灭菌，是最有效的一种灭菌方法。主要应用范围是布类、橡 胶制品（如胶塞）、金属器械、玻璃器皿、某些塑料制
5、品以及加热后不发生沉淀的无机溶液（如Hanks 液、PBS、20XSSC等）。手动高压灭菌锅操作如下： 首先查看高压锅内的水是否充足，放人物品盖好盖。 加热高压锅。将放气阀打开，放气510 min，以排除锅内的冷空气。 待锅内水沸腾后，落下放气阀继续升温升压，玻璃器皿等用15磅（121C）30 min,胶塞、塑料 制品、溶液等可用10磅（115 C）20 min。调节火力大小保持该压力。 停止加热，待压力自然下降至0再打开放气阀排汽，开盖，取出高压灭菌的物品烘干。电热自动灭菌锅使用说明（型号：SANYO Autoclave MLS-3020）: 放气筒加水至LOW水平线处，将与高压锅相连的导气
6、管插入放气筒里，然后将放气筒归于原位。 打开高压锅盖，加入蒸馏水至高压锅底的水位线，水位线位于V型凹槽的1/3 2/3处。 打开电源。 设定高压温度及时间，高压锅的温度范围为105 121C，高压灭菌一般采用121C2030 min。 把待高压的物品置于高压锅内，顺时针方向将exhaust钮旋至close位置。 关闭咼压锅盖，旋至显示屏上左上角的红亮点刚出现为止。 按st art钮，开始高压，在温度达80C时显示器开始显示温度，当温度达到所需的设定温度时, 在显示屏的左下角有一长形的指示灯闪亮，直到高压时间结束后指示灯灭，此时蜂鸣器报警一声。 当压力降至0 MPa时，蜂鸣器再报警一声。温度降至
7、80C时，蜂鸣器报警10次。显示屏温度指 示消失，此时才可打开锅盖。 关电源，开高压锅盖，取出已灭菌的物品，烘干。（4）滤过除菌 用于培养用液和各种不能高压灭菌的溶液的灭菌。采用金属滤器和小型的塑料滤器， 配上可以更换的微孔滤膜，极大地方便了操作。滤器型号按直径大小划分。如过滤量大的培养用 液常用较大型号的金属滤器（直径90 mm、100 mm、142 mm 等），配以过滤泵使用。过滤量较 小的液体常用注射器推动的塑料小滤器（直径20 mm、25 mm等）。滤膜孔径有0. 60 p m、0. 45 p m、 0. 35 p m、0. 22 p m、0. 10p m等，以0. 22 p m除菌最
8、为保险，但对于较粘稠难滤过的液体, 仍需选用孔径较大的滤膜。 在过滤器上装上微孔滤膜，孔径为0. 22p m。 用布包好，湿热灭菌后使用。2. 化学消毒法 常用的消毒液有如下几种：（1）70（或75）酒精：超净台里常备70酒精棉球（卫生级酒精），用于手和一些金属器械或工 作台面的消毒。（2）0.1新洁尔灭：主要用于手和前臂的清洗以及工作后超净台面的清洁。超净台旁应常备盛有 0.1新洁尔灭溶液的容器及纱布。（3）来苏儿水（煤酚皂溶液）：主要用于无菌室桌椅、墙壁、地面的消毒和清洗，以及空气喷撒消毒， 特别是污染细胞的消毒处理。使用浓度请按瓶上说明。（4）0. 5%过氧乙酸：是强效消毒剂，10 mi
9、n即可将芽抱菌杀死。用于各种物品的表面消毒，用 喷撒和擦拭方式进行。（5）乳酸蒸气：将乳酸放入坩锅内用酒精灯或电炉加热至沸腾为止。将门窗紧闭13 d。可将空 气中漂浮的微生物杀死。（6）37%甲醛加高锰酸钾：使用前先紧闭门窗。将37%甲醛用酒精灯或电炉加热至沸腾后断电或 灭火。用一张纸盛好适量的高锰酸钾，迅速放人已加热好的甲醛中形成蒸气。13d后方可达到 消毒空气的目的。3. 煮沸消毒急性消毒可用煮沸法，器械等煮沸15 min后使用。五、注意事项1清洗玻璃制品时，浸酸之后一定要用自来水冲洗 1015 次。因为残存的洗液对细胞粘附有很 大影响。清洗塑料制品时要用棉花或柔软纱布擦洗。千万不要用硬毛
10、刷，否则损害塑料表面后细 胞不易贴壁。Tip和Tube 定要用超声清洗处理后逐个清洗。如没有洗净会影响下一次使用的效 果。2. 干热灭菌时，应在白天使用烤箱，并不断观察，以免发生意外。当温度超过100C时，不能再 打开烤箱门。器皿烤完后，待温度降至100C之下才能开烤箱门。金属器械和橡胶、塑料制品不 能使用干热灭菌方法。.3. 高压灭菌后器皿务必晾干或烘干，以防包装纸潮湿发霉。4. 牛血清、大部分培养基、胰酶和一些生物制剂是有机溶液，均不能高压（如TdR，秋水仙素， 谷氨酰胺，异硫氰酸胍， MOPS 等）。5. 滤过除菌时，滤器在使用前先装好滤膜（有时可在上面加一层定性滤纸），包好，经高压灭菌
11、后 才能使用。滤过酶类制剂时应待滤器温度降至室温下再进行。过滤时压力不宜过大，压力数字以2 为宜。压力太大时微孔滤膜可能破裂，或使某些微生物变形而通过滤膜。装滤膜时位置要准确。 另外滤器包装时，螺钉不要拧得太紧，以防高压蒸汽不能进入，待高压灭菌之后，再拧紧使用。6. 使用化学消毒法时，配制 75酒精应用卫生级，不要用化学纯、分析纯和优质纯酒精。来苏 儿水不能用于皮肤消毒，它对皮肤有刺激性。空气消毒时，所有的物品要事先准备齐全并使消毒 者有较方便的退出途径。因为甲醛或乳酸加热后放出的蒸气对人的角膜和呼吸道上皮有严重的刺 激和伤害作用。物制品无菌试验规程 生物制品不得含有杂菌（有专门规定者除外），
12、灭活菌苗、疫苗不得含有活的本菌、本毒。在 制造过程中应由制造部门按各制品制造及检定规程规定进行无菌试验，分装后的制品须经质量检 定部门做最后检定。各种生物制品的无菌试验除有专门规定者外，均应按照本规程的规定进行。1 抽样1.1 原液及半成品 原液及半成品应每瓶分别进行无菌试验，其抽样量应至少为 0.1%，但不得少于 1.0ml。1.1.1 大罐稀释的制品抽样数量不得少于 10ml。1.1.2 原液及半成品每开瓶一次，应如上法抽验。1.2 成品 每亚批均应进行无菌试验，样品应随机抽取，应具有代表性（包括分装过程的前、中、后样品）。121分装量在100支（瓶）或以下者抽检不少于5支，101500支
13、（瓶）者抽检不少于10支（瓶），50110000支（瓶）者抽检不少于20支（瓶，10001支（瓶）以上者抽检40支（瓶）。122每瓶装量20ml以上的冻干血液制品，每柜冻干200瓶以下者抽检2瓶，200瓶及以上 者抽检4瓶。620ml抽检量加倍。5ml和5ml以下者按121项抽检。1.3 凡规定需作支原体检查的制品，均应在半成品时按亚批进行检查，成品可不再做。2 无菌试验用培养基（培养基处方可附录 1）2.1 检查制品中本菌是否存活应采用适于本菌发育生长的培养基（在半成品时检查，有专门 规定者除外）。2.2 检查需氧性和厌氧性杂菌应采用硫乙醇酸盐培养基。检查不含汞类防腐剂制品中的需氧 性和厌氧
14、性杂菌时，该培养基中可不加硫乙醇酸盐。检查霉菌和腐生菌应采用改良马丁培养基。 检查混浊制品可采用不含琼脂的硫乙醇酸盐培养基。检查活菌苗时可加大琼脂含量，做成斜面。2.3 检查支原体应采用猪胃消化液半固体或牛心消化液半固体培养基。2.4 生物制品无菌试验用培养基亦可用经检定合格的干燥培养基配制。2.5 无菌试验培养基的灵敏度，乙型溶血性链球菌（32210 株）应达到 10-8，短芽胞杆菌（7316 株）和生抱子梭状芽胞杆菌（64941株）应达到10-7，白色念珠菌（ATCc 10231）和腊叶芽枝霉 应达到 10-6。2.6 生物制品无菌试验培养基由质量检定部门与培养基制造部门会同进行灵敏度试验
15、。每当 更换主要原材料时，应进行灵敏度试验，合格后方可应用（灵敏度试验法见附录 2、3）。2.7 各生产单位的质量检定部门应定期抽检无菌试验培养基的灵敏度，检定所应定期抽检各 所的无菌试验培养基。3 无菌试验方法3.1 无菌试验取样、移种等全部操作，应在无菌操作室内或无菌条件下进行，无菌操作室应 经常保持清洁，在每次操作前，应彻底消毒。3.2 菌苗、疫苗、类毒素、抗毒素类制品及粘稠不易过滤的血液制品应用直接接种法进行无 菌试验。人白蛋白及人丙种球蛋白（包括各种剂型及应用途径的制品）应用薄膜过滤法进行无菌 试验，其他血液制品亦可用薄膜过滤法或直接接种法进行。3.3 直接接种法3.3.1 菌苗、疫苗、类毒素、抗毒素类制品3.3.1.1每安瓿装量5.0ml以上者（不含5.0ml）取样不应少于1.0ml,装量在5.0ml以下者（含 5.0ml）取样不得少于0.5ml，装量不足0.5ml者，全部吸取。3.3.1.2 含防腐剂的制品，接种量与培养基的比例：用苯酚或氯仿作防腐剂者至少为 1:20， 用汞作防腐剂者或制品内含有甲醛、抗生素者至少为 1:50。先按此比例接种于硫乙醇酸盐培养基 内增菌，于2025C培育34天后移种至硫乙醇酸盐培养基、适宜的琼脂斜面、改良马丁培养 基各2管，每管0.5ml。将硫乙醇酸盐培养基、适宜的
