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1、2023神经母细胞瘤基因组结构性变异特征的研究进展摘要神经母细胞瘤(neuroblastoma,NB)是起源于神经靖细胞的儿童胚胎恶性肿瘤，表现为较强的生物学和临床异质性。基因组测序研究显示，NB具有较低的突变负荷和频发突变。NB表现为携带较多的基因组结构性变异，是其发生、发展的重要驱动因素。临床上已将MYCN扩增和Ilq缺失等基因组结构性变异纳入风险分组中，但目前对于NB基因组结构性变异的了解与NB的生物学、临床复杂性仍存在差距。高通量基因组学技术的发展推动了研究者对NB基因组特征尤其是结构性变异特征有了更加全面的认识，为探索NB发生、发展机制以及更加精细的风险分层提供了数据基础。本文就近年
2、来NB的基因组结构性变异特征研究进展进行综述。、,.刖音神经母细胞瘤(neuroblastoma,NB)是一种儿童早期的胚胎性恶性肿瘤，起源于神经噎细胞，表现出较高的生物学、形态学、遗传学和临床特征异质性。基因组学高通量技术加深了研究者对NB的发病分子机制的认识。NB具有相对较少的体细胞单核苗酸变异(SNVs)和小片段的插入和缺失(indels),突变负荷约0.5-1MB1-2oNB的突变特征(mutationalsignature)以CA和CT为主2,具有较低的频发突变（recurrentmutation）,因此以单碱基变异，小片段插入、删除为基础探索NB基因组特征具有一定局限性。目前的研究
3、表明，基因组结构性变异是NB关键的驱动因素3-4。基因组结构性变异，通常是指基因组上大片段的序列变化和位置关系变化。其主要类型包括长片段序列（通常50bp以上）插入或者删除、串联重复（tandemrepeat染色体倒位（inversion染色体内部或染色体之间的序列易位（translocation拷贝数变异（CNV）以及形式更为复杂的嵌合性变异。在NB中，以MYCN扩增、染色体IIq缺失为代表的基因组结构性变异特征已经纳入了临床NB患儿的危险度分组中。随着NB基因组测序的进展，越来越多的基因组结构性变异特征被挖掘。因此，了解NB基因组结构性变异方面的新进展有助于加深对这些变异在NB发生、发展以
4、及侵袭转移中作用的认识，进而与临床特征进行结合，为患儿个性化精准诊疗提供指导。本文总结NB的基因组结构性变异特征，旨在探讨其高度侵袭性及异质性的基因组基础，为探索NB发生、发展机制以及精准诊疗提供理论基础。01、NB染色体拷贝数变异染色体拷贝数变异是指整个染色体或染色体片段拷贝数目的改变，通常提到的拷贝数变异一般指染色体片段拷贝数变异。染色体拷贝数变异是NB主要的基因组结构性变异形式，其与临床分期、风险分组密切相关。NB中常见的染色体拷贝数变异如MYCN扩增、ALK扩增、11q缺失、1P缺失和Vq获得，提示着高复发风险和预后不良5。1.1 MYCN扩增MYCN位于染色体2p24区域,是MYC癌
5、基因家族的成员，作为转录调控因子，在NB的分化、增殖、存活、代谢、转移和血管生成等过程中发挥调控作用。MYCN基因异常扩增是高危NB的重要驱动因素，也是NB最重要的预后因子。研究表明20%左右的NB伴随MYCN扩增,在高危NB中，这一比例可以达到40%50%6oMYCN扩增与NB的高侵袭性密切相关。研究表明，NB中MYCN扩增是一个早期且导致高危NB发展的始发事件6-7。MYCN基因编码的N-myc蛋白是细胞生长、代谢和分化的主要转录调节因子。MYCN扩增导致其过表达是MYCN影响NB发生、发展的重要方式。染色体易位导致远端增强子元件的扩增或者高活性增强子劫持是MYCN过表达的重要机制8。其他
6、影响MYCN过量表达方式，如MYCN磷酸化失调或MYCN突变（如P44L）引起的MYCN蛋白稳定增加，也是其参与NB发生、发展的重要机制。1.2 ALK扩增ALK是一种受体酪氨酸激酶，通常只在发育中的胚胎和新生儿大脑中表达。ALK是NB中最常见的突变基因l6%12%的NB携带ALK体细胞突变。研究发现，ALK扩增也是NB预后相关特征。研究显示1%2%高危NB伴随ALK扩增，从而增加ALK活性9。ALK扩增几乎不与ALK热点突变同时出现，但ALK扩增倾向与MYCN扩增同时发生。在国际儿科肿瘤学会欧洲神经母细胞瘤学组（SIOPEN）研究中，97%的ALK扩增肿瘤伴随MYCN扩增10,这可能与两个基
7、因在染色体位置邻近相关（ALK位于2p23ALK扩增的NB预后显著不良，5年总体生存率约26%o具有ALK扩增的NB展现出ALK通路激活与MYCN扩增相关通路激活的叠加生物学效应，表现出更差的生存率。临床前试验数据显示，与ALK突变的NB患儿不同，ALK扩增的患儿对克理替尼等ALK抑制剂缺乏反应11。上述数据提示，ALK扩增的患儿可能是一个独立的、预后差亚群，在临床诊疗中需要设计针对性治疗方案。1.3 IIq缺失11号染色体长臂缺失（IIq缺失）是NB中最常见的基因组结构性变异事件之一，20%45%的NB携带此变异。临床上，11q缺失与较高疾病分期和较低生存概率有关。2009年国际神经母细胞瘤
8、风险协作组（INRG）将IIq缺失纳入了NB患儿临床风险分级体系中。11q缺失与MYCN扩增为互斥事件，但其倾向与17q扩增、3p缺失共同发生4。由于11号染色体长臂区域较长，包含众多微小区域和基因，所以确定11q具体发挥功能的区域和基因有待进一步探索。不同的研究组确定了一些位于IIq区域的候选基因，如CADM1、ATM、H2AFX等,虽然这些基因的生物学功能已经比较明确，但其在NB中发生、发展中的作用需进行验证。为进一步确定IIq影响NB的功能区域，研究者进一步缩小研究范围，确定11q23区域可能是潜在的重要区域，目前临床检测和基础研究中同样将11q缺失的检测探针设计在此区域。由于IIq是1
9、1号染色体的整个长臂区域，如此长的片段也导致其不同微区域变异情况并非完全一致。近期NB基因组整合分析发现，Ilq的11q13.3区域在一些NB样本中显著扩增4,与研究中NB样本和细胞系中检测至JCCND1(位于11q13.3魁表达相呼应。CCNDlCDK4CDK6形成复合物调节细胞周期G1/S转换。在NB中，抑制CCND1可使得细胞增殖显著减少和促进神经元分化12o上述研究显示，在NB中IIq区域是功能重要并且比较复杂的区域。如何结合基因组大数据分析，开展基础和临床研究，确定具体的功能区域或重要功能基因是目前亟需探索研究的问题。1.4 IP(IP36)缺失1p36缺失普遍存在于人类癌症中，其在
10、神经系统肿瘤中尤为常见。NB中约30%患儿携带1p杂合性缺失口3-14虽然1p36杂合性缺失与患儿预后相关，但多因素分析显示，1p36杂合性缺失不能作为一个独立的预后因子14;1p36杂合性缺失倾向与MYCN扩增同时发生，约70%的MYCN扩增肿瘤同时携带1p36杂合性缺失；同时携带这两种变异的NB患儿是一类极度高危人群，倾向于骨髓转移和较差的临床预后。尽管研究显示，位于1p36区域的CHD5、ARlDlA等抑癌基因缺失是此区域影响肿瘤发生、发展的内在机制15,但仍需进一步探索1p36在NB中的作用机理以及其与MYCN同时发生的内在机制。02、染色体结构变异染色体大片段结构性变异除了染色体拷贝
11、数异常以外，还有包括缺失、重复、倒位和易位等类型的染色体结构变异，以及几种变异类型同时发生的更加复杂的基因组结构性变异方式，如染色体破裂。染色体结构变异是肿瘤发生、发展的重要驱动因素，NB中存在普遍的染色体结构变异，同时其频率、类型和定位在NB,尤其是高危NB中存在较大差异。有研究应用全基因组测序对19例高危NB分析发现，平均每个样本携带40个染色体断裂位点。TERT基因重排是NB中常见的染色体结构变异。在75例高分期NB中，15例检测到TERT基因重排16,此研究发现对于高危NB,MYCN未扩增肿瘤的串联重复明显增多。同时结构变异的复杂性在MYCN未扩增的高危肿瘤中更为明显3。对染色体结构变
12、异所影响的基因进行分析发现结构变异更倾向于破坏NB的神经发育相关基因。有研究显示参与神经元分化或在神经传递和突触中发挥作用的一些基因，如SHANK2、DLG2、AUTS2、CNTNAP2xNRXNl和CTNND2等，在基因组结构变异断点所破坏的基因中富集3。染色体结构变异如何影响NB发生、发展的机制比较复杂，目前还缺乏深刻地认识。染色体结构变异介导的增强子劫持或局域增强子扩增是影响NB的重要机制，其通过这样的方式对MYCN致癌基因异常调节或通过激活端粒酶逆转录酶基因(TERT)影响端粒维持。同时，肿瘤中的基因组结构变异T殳不以单一类型出现，更倾向于以多种类型同时发生的复杂形式呈现，进一步增加了
13、复杂性，进而使得NB的生物学行为和临床表现呈现复杂性。虽然复合型结构变异增加了基因组结构变异识别难度，但探索研究新的复合型结构变异会加深对NB复杂性的认识，为挖掘其发生、发展的机理提供新的角度。2.1 染色体破裂染色体破裂(Chromothripsis)是复杂的染色体结构变异，指在一个单一的灾难性事件中，染色体区域分裂成较小片段，重新排列、连接,导致一个新的基因组组装。染色体破裂与肿瘤生长、耐药密切相关。NB也存在着此种复杂的染色体结构变异。研究显示在多达18%的高分期NB中检测到染色体破裂,并且与临床预后差相关口7o在TARGETNB数据集中,约19%的高风险NB发生染色体破裂事件3。在NB
14、中染色体破裂事件在很大程度上与MYCN在2p上的扩增和TERT在5p上的扩增相重叠，表明染色体变异事件发生后，染色体纯化选择是造成这些改变的一个重要原因3,16。同时部分染色体破裂与TERT基因的共定位，可以提高TERT基因表达水平，导致NB的端粒长度增加，表明其可以通过影响肿瘤细胞增殖能力，进而影响肿瘤进展。研究发现染色体破裂与1p杂合性缺失密切相关，可能是由于其通过一些位于染色体1p36的抑癌基因等位基因缺失来抑制NB细胞分化。2.2 染色体外环状DNA在染色体碎裂的过程中，一部分染色体片段进行了重新排序组装，还有部分染色体片段呈环状存在于染色体外，称为染色体外环状DNA（extrachr
15、omosomalcircularDNA,ecDNAXecDNA可以通过各种细胞周期事件产生,但形成的确切机制尚不清楚。在使用最广泛的ecDNA形成模型中，复制叉停滞导致复制叉崩溃，然后导致复制气泡从染色体上脱落、相互连接，从而导致ecDNA形成。在ecDNA中，除了完整的基因，还包含非编码序列，如启动子和增强子。ecDNA与一些原癌基因扩增相关,是肿瘤耐药的重要原因,其与预后差相关。Kohl等首次在NB的ecDNA中发现了MYCN基因,这也是第一次在ecDNA中发现一个癌基因口8o在此之后，NB染色体外DNA环化的完整图谱逐渐建立起来，同时也证实了MYCN基因在NB的ecDNA上扩增。随后对9
16、3例NB检测发现,平均每个肿瘤含有0.82个ecDNA190在NB中，ecDNA大致可分为两种类型:1）近端增强子的扩增所需，由去甲肾上腺素核心调节回路（CRC）控制；2）没有近端增强子，然而在较远的染色体区域有CRC驱动的增强子,从而劫持远端增强子以弥补局部基因调节元件的不足，这种类型在包含MYCN并导致其扩增的ecDNA中占据主要部分20。同时,ecDNA也可促进TERT的表达,从而参与端粒维持。总体而言，ecDNA通常携带如MYCNsJUNxMDM2、SOX11等癌基因发生扩增19-20,在有丝分裂过程中通过不均匀的分离，ecDNA可以在癌细胞中积累，使其在响应肿瘤微环境和细胞毒性治疗药物中的选择具有竞争优势，从而促进肿瘤的发生、发展。03基因组不稳定性肿瘤基因组不稳定性包括基因组一系列的改变从小的缺失/插入至整个染色
