免疫组化相关问题-个人总结

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1、免疫组化步骤一般的sp法步骤啊，具体如下：1. 烤片，68C，20分钟，2. 脱蜡：依次将载玻片放入二甲苯-二甲苯-100%酒精-100%酒精-95%酒精-90%酒精 -80%酒精-70%酒精，起脱蜡作用的主要是二甲苯，依据的是相似相溶的原理.一般在每个试剂 中放10min，天气热可以少放几分钟，相反,天气较冷的话，就要适当延长脱蜡时间，一般为 12-15min.3. 抗原修复：脱蜡后在清水中冲洗一段时间，加入3%H2O2-甲醇溶液浸泡10min，从 而除去内源性的过氧化氢酶，然后倒掉H2O2，在清水中洗两次，再加入柠檬酸缓冲液，放 入微波炉中蒸煮3min （中火），一般刚到沸腾即可，冷却至室

2、温，然后再蒸煮一次，冷却至 室温，蒸煮的目的是为了使抗原的位点暴露出来。4. 血清封闭：冷却至室温后，将柠檬酸缓冲液倒掉，水洗2次，并将载玻片置于PBS 中5min，洗2次，擦干组织周围的PBS液，马上加上血清，使一些非特异性的位点封闭起 来，然后放入37 C温箱中半小时。血清稀释10倍（900glPBS： 100gl血清封闭液）。5. 加一抗：将温箱中的载玻片取出，用吸水纸擦干载玻片反面和正面组织周围的血清， 不洗，加一抗，如果做对照实验，就在对照的组织上加PBS。加完一抗后于4 C冰箱中保 存过夜（318h）。6. 加二抗：将载玻片从冰箱中取出，4C过夜后在37C复温45分钟，放入PBS中

3、洗3 次，每次5min，擦干组织周围的PBS后加上二抗，然后置于37 C温箱中半小时。7. 加SABC:将片子从温箱中取出，放入PBS中洗3次，每次5min，擦干组织周围的PBS 后加上SABC，然后置于37 C温箱中半小时SABC稀释100倍（990plPBS： 10glSABC）o8. 加显色剂：将片子从温箱中取出，放入PBS中洗3次，每次5min，擦干组织周围的 PBS后加上显色剂。（显色剂的配置：在1ml水中加1滴显色剂A，摇匀，然后加1滴显色 剂B，摇匀，再加1滴显色剂C，摇匀）A： DAB B： H2O2 C：磷酸缓冲液9. 复染：将显色后的片子用清水冲洗一段时间后，浸泡于苏木精中

4、染色，一般动物组 织为半分钟，植物组织3-5min。然后盐酸酒精分化。10. 脱水：将复染后的片子置于水中冲洗后，依次将载玻片放入70%酒精-80%酒精-90% 酒精-95%酒精-100%酒精-100%酒精-二甲苯-二甲苯。每个试剂中放置2min，最后浸泡在二 甲苯中，搬到通风柜中。11. 封片：用中性树胶滴在组织旁边，再用盖玻片盖上，要先放平一侧，然后轻轻放下 另一侧，以免产生气泡，封好片子后置于通风柜中晾干。免疫组化技术要点1. 固定最好用4%的多聚甲醛固定液。对于冰冻切片，甲醛固定有时比冰冻丙酮好；但对于不同的 组织和抗原，可选用不同的固定液。有时候商品化的抗体会有比较适合而推荐的固定液

5、， 请于购置前注意说明书。（1）BouinS固定液：饱和苦味酸750ml，甲醛250ml，冰醋酸50ml，其对组织的穿透力较 强，固定较好，结构完整，但因偏酸，对抗原有一定损害，且组织收缩明显，不适于组织标 本的长期保存。（2）PLP液：即高碘酸钠-赖氨酸-多聚甲醛，适于固定石蜡切片。适于富含糖类组织，对 超微结构及许多抗原的抗原性保存较好。2. 组织脱水、透明时间不能太长，否则在切片时容易碎片，切不完整。3. 切片时展片有些组织在切片后难以在水中展开，这时可适当地在水中加入几滴乙醇。4. 烤片60r 30分钟或37r过夜，温度太高或时间太长，抗原容易丢失。5. 蜡块及切片的保存最好在4 r保

6、存.6. 脱片问题Poly-L-Lysine（多聚赖氨酸）为目前免疫组化染色工作中最常用的一种防脱片剂，6ml的多聚 赖氨酸溶液可按1:10稀释成60ml的工作液，适合于需要酶消化、微波、高温高压的防脱片 处理。如不行，可用双重处理（APES和Poly-L-Lysine）的切片。在以上两种条件都行不通 的情况下，可用如下方法：切片在脱蜡前，放在APES 1:50丙酮溶液中浸泡3分钟，晾干， 即可进行下一步。7. 灭活内源性酶（1）HRP系统：3%双氧水灭活（2）AP系统：3%HAc灭活。8. 暴露抗原对于石蜡切片的免疫组化实验时，必须采用高温加热抗原修复，这将有助于暴露抗原决定簇， 从而增加免

7、疫组化染色的强度（不同抗体的最佳修复液请参阅抗体说明书）。对于不同的组 织，不同的抗原，不同的抗体，所采用的方法应不一样，可进行热修复、胰酶消化、既不修 复也不消化。胶原还可以用胃蛋白酶消化等。9. 封闭在山羊血清封闭，非特异性染色仍然较强时，可延长封闭时间或用浓缩血清封闭10. 抗体稀释应遵循“现用现配”的原则，对于PBS稀释的抗体一定要当天使用。11. 背景高在抗体浓度、反应时间、反应温度等合适的条件下，如果背景依旧高，可采用含1%。Tween20 的PBS洗，特别是在显色之前要多洗。12. 返蓝在苏木素复染后，可用碱性缓冲液（如PBS）或Na2HPO4的饱和溶液返蓝。13. 显色一定要在

8、显微镜下观察，注意控制背景。14. 在整个操作过程中，切片千万不能干燥，否则会有非特异性染色。15. 拍照免疫组化切片一般染色不太深，因此拍摄出的照片颜色较浅，就让它浅。拍摄出的照片中空 白部位应尽可能呈现纯白色。测量其灰度应在250左右。如果呈现淡蓝色，一般是相机自动 白平衡在起作用。另外一个因素是显微镜灯光电压不正确。要使灯光本身的色温正确。既不 偏黄，也不偏蓝。抗原修复的几种方法一、柠檬酸钠法1. 把玻片放在玻璃固定架上，再将架子放在盛有600ml的10mM柠檬酸钠（pH6.0）的容器 中。2. 微波中高火6-8min。3, 室温冷却。4, 用PBS洗涤3次，每次5min。二、蛋白酶K法

9、1. 配制新鲜溶液：25l 20mg/m蛋白酶 K；2.5ml 1MTris-HCl（pH8.0）；0.5ml 0.5M EDTA（pH8.0）；加水定容到50ml。2. 37C下，将玻片放在架子上孵育5min （蛋白酶K不要预热）。3. 用PBS洗涤3次，每次5min。三、尿素法1. 把玻片放在玻璃固定架上，再将架子放在盛有600ml的1M尿素（新鲜配制）的容器中。2. 微波10min，20min或者30min，每5min补充一次蒸发掉的水。3. 冷却 30min 到 1h。4. 用蒸馏水洗涤4次，每次3min,再用PBS洗涤3min。免疫组化SP法步骤1. 烤片，68 C，20分钟，2.

10、常规二甲苯脱蜡，梯度酒精脱水；二甲苯I 20min-二甲苯II 20 min-100%酒精I 10min -100%II 10min -95% 5min- 80% 5min- 70% 5min3, 阻断 灭活内源性过氧化物酶：3%H2O2 37C孵育10min，PBS冲洗3X5min；4, 抗原修复:置0.01M枸橼酸缓冲液（PH 6.0）中用煮沸（95C，15 20min），自然冷却20min 以上，再用冷水冲洗缸子，加快冷却至室温，PBS冲洗3X5min。5, 正常羊血清工作液封闭，37C10 min，倾去勿洗.6, 滴加一抗4C冰箱孵育过夜，PBS冲洗3X5min （用PBS缓冲液代替一

11、抗作阴性对照）； 滴加生物素标记二抗,37C孵育30min, PBS冲洗3X5min;7. 滴加辣根过氧化物酶标记的链霉素卵白素工作液，37C孵育30min, PBS冲洗3X5min;8. DAB/ H2O2反应染色，自来水充分冲洗后，苏木素复染，常规脱水，透明，干燥，封片。SP法1）脱蜡、水化；2）PBS洗23次各5分钟；3）3%H2O2 （80%甲醇）滴加在TMA上，室温静置10分钟；4）PBS洗23次各5分钟；5）抗原修复；6）PBS洗23次各5分钟；7）滴加正常山羊血清封闭液，室温20分钟。甩去多余液体。8）滴加I抗50p l，室温静置1小时或者4C过夜或者37C1小时。9）4C过夜后

12、需在37C复温45分钟。10）PBS洗3次各5分钟；11）滴加II抗4050p l，室温静置，或37C1小时；12）II 抗中可加入 0.05%的 tween-20。13）PBS洗3次各5分钟；14）DAB显色510分钟，在显微镜下掌握染色程度；15）PBS或自来水冲洗10分钟；16）苏木精复染2分钟，盐酸酒精分化；17）自来水冲洗1015分钟；18）脱水、透明、封片、镜检。SABC 法1）脱蜡、水化。2）PBS洗两次各5分钟。3）用蒸馏水或PBS配置新鲜的3%H2O2，室温封闭510分钟，蒸馏水洗3次。4）抗原修复。5）PBS洗5分钟。6）滴加正常山羊血清封闭液，室温20分钟。甩去多余液体。

13、7）滴加I抗，室温1小时或者4C过夜或者37C1小时（4C过夜后在37C复温45分钟）。8）PBS洗三次每次2分钟。9）滴加生物素化二抗,20C37C20分钟。10）PBC洗3次每次2分钟。11）滴加试剂SABC，20C37C20分钟。12）PBS洗4次每次5分钟。13）DAB显色：DAB显色试剂盒或者自配显色剂显色（镜下掌握显色程度）。14）蒸馏水洗。苏木素复染2分钟、盐酸酒精分化。15）脱水、透明、封片、镜检。石蜡组织切片的HE染色1. 取材组织块，经固定后，常规石蜡包埋，4Mm切片。2. 切片常规用二甲苯脱蜡，经各级乙醇至水：二甲苯（D 5minf二甲苯（II） 5min f 100%乙

14、醇2minf 95%的乙醇1minf 80%乙醇1minf 75%乙醇1minf蒸馏水洗2min。3 .苏木素染色5min，自来水冲洗。4. 盐酸乙醇分化30s （提插数下）。5. 自来水浸泡15min或温水（约50C） 5min。6. 置伊红液2min。7. 常规脱水，透明，封片：95%乙醇（I） minf95%乙醇（II） 1min-100%乙醇（I） 1minf 100%乙醇（II） 1minf 二甲苯石碳酸（3： 1） 1minf 二甲苯（I） 1minf 二甲苯（II） 1minf中性树脂封固。1. Harris苏木紫液：甲液：苏木素1g，无水乙醇10ml。乙液：硫酸铝钾（或铵）20

15、g，蒸馏 水200ml，加温溶解。甲、乙二液分别溶解后混合，加热煮沸，沸后去火，待溶液不沸腾时 即加入氧化汞0.5g （此时有大量气泡生成，故容器宜大，以免液体溢出）。然后染液迅速冷 却，冷却后过滤，即可应用。用时每100ml加冰醋酸4ml；2. Mayer苏木素液：将苏木素0.1g放入蒸馏水100ml中煮沸溶解，再加入硫酸铝钾5g，和 碘酸钠0.02g，搅动直到全部溶解，加入水合氯醛5g和枸椽酸0.1g，加煮沸5min，冷却、 过滤，放置过夜，即可应用。染色时间约1020min；3. Ehrlich苏木素：将苏木素2g溶于无水乙醇100ml中；将硫酸铝钾15g溶于蒸馏水100ml 中，加入甘油100ml，将二液混合，最后加入冰醋酸10ml，充分混匀后，盛于无色小口瓶 内，暴露于日光下，使其自然成熟，约需3个月。染色时间约520min。此液贮存愈久，染色力愈强。若在其中加入碘酸钠300mg，使人工成熟，配成后即可应用；4. Carrazzi苏木素：将苏木素0.5g溶解于甘油100ml中，将硫酸铝钾25g溶解于蒸馏水 350ml中溶解后将二液慢慢混合，并充分摇匀