《人重组白细胞介素8在大肠杆菌的表达鉴定》由会员分享，可在线阅读，更多相关《人重组白细胞介素8在大肠杆菌的表达鉴定（10页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、人重组白细胞介素-在大肠杆菌的表达、鉴定【摘要】目的利用CR技术扩增hIL cD，将其连接于原核表达载体pKpL-3(含PL启动子)中,并在大肠杆菌中表达、鉴定。方法 R技术扩增hL- cDNA获取目的基因，将该基因重组到大肠杆菌表达载体pKpL3a质粒中,重组NA分子转化到Pop3大肠杆菌中，利用其所产生的温度敏感性阻遏蛋白来调控外源基因表达,经ELSA反应检测其表达水平。结果 带hIL-8基因的重组pKpL3a质粒成功转化到P2136大肠杆菌中,经诱导,表达了IL-8并经ELSA反应检测了其表达水平。结论：IL-8成功在大肠杆菌中表达。【关键词】hL-8PCR 重组基因 表达正文趋化因子（
2、Chmine)是一组具有趋化作用的细胞因子，能吸引免疫细胞到免疫应答局部,参与免疫调节和免疫病理反应。白细胞介素-8(nterluk-8）属于趋化因子家族成员，其分子中含有CysX-C的三联氨基酸序列，因而属于CC趋化因子亚家族（家族）。IL8的重要生物学功能是对中性粒细胞、嗜碱性粒细胞和T细胞具有区划作用，并可促进中性粒细胞的活化，在炎症反应中是一种重要的炎症因子。另外，IL-8还具有促进造血细胞增殖及新生血管生成作用,在伤口愈合和肿瘤生长及转移的过程中发挥重要作用。由于天然来源的L-8含量极低，难以大批量制备，因而只能利用基因工程技术进行表达和生产。其基本过程是:获取目的基因；表达载体的选
3、择和构建;目的基因与表达载体的拼接；重组NA分子转化到大肠杆菌;使其复制转录并合成重组的免疫分子。利用重组技术,可使大肠杆菌成为生产IL-8的生物工厂。这种生物工厂一旦建造成功,只要供给大肠杆菌适当的生长条件， 就可提供取之不尽的IL-8。1 材料与方法1.1 主要材料1.1 菌株与载体Pop136大肠杆菌和含pKpLa质粒的大肠杆菌由本实验室提供。11 工具酶与试剂TaqDA聚合酶及其ffer购于北联生物医学工程公司。dTPmx购于Takaa公司。Kleow酶购于北联生物医学工程公司。内切酶Sy、Xba购于aka公司。4 N连接酶及其buffer购于aara公司。1.1.3 PCR引物的设计
4、、合成上游引物:ag gct aagaa ct aga gt;下游引物:ccgct aga tttg t ata c c c（内含Xba酶切位点和AA终止密码）由Taara公司合成。1.1 主要仪器PR仪,微量加样器(20、20l、l）,高速台式离心机,Y0型电泳仪、电泳槽、凝胶成像系统,水浴摇床，孵箱,酶标仪,一次性酶标板等。.2 试验方法.1PCR技术扩增hIL-8cDNA在ppendor管中依次加入下列成份构建总体积为0l的反应体系:dd2 37、10bufer 5l、dNTix 5l、上游引物1l、下游引物1l、cD模板1、Ta酶l。调节PR仪,设置5预变分钟。 430秒，6030秒，
5、72分钟，反应0个循环。最后72再延伸5分钟。在设定好的PC仪上进行反应。反应结束后取出10l进行琼脂糖凝胶电泳。向管中余下的40l反应体系中加入Kleo酶 l，室温0分钟，以修平扩增片段的3末端。之后转至1.5m离心管中，加入50l酚氯仿-异戊醇并混匀，100rpm,30秒离心。吸取上层清液转至另一已加入5l 3M NA的1.m离心管中,加入15无水乙醇，-0放置小时。1000rpm,1分钟离心,弃上清，加入0.5l0%乙醇，0000rpm,5分钟离心,弃上清,空气中干燥,溶于20l T。12.2 DA琼脂糖凝胶电泳配置.8琼脂糖凝胶板。充分凝固后从制胶槽中卸下凝胶板,放入电泳槽，加入E（)
6、,使其液面略高于琼脂糖板，拔出样品梳。DA样品0加5lBS样本液,在蜡面纸上混匀,全部加样于琼脂糖的样品孔中。稳压电泳0v约小时,是溴酚蓝指示剂泳动到适当位置，-5/cm。取出凝胶板置溴化乙锭中染色20分钟。在凝胶成像仪观察结果。 质粒提取从转化平皿上接种一单菌落到L培液体养基中,3震荡培养,待细菌浓度增至OD60=1.5时,收获细菌。取菌液1m转至penorf管中，8000p，分钟离心，弃上清。加入200l缓冲液，充分混匀。加20l碱溶液裂解细菌，反复倒转管5次至溶液清亮，开盖后能拉出丝状粘稠液体。加200乙酸缓冲液，反复倒转管5次混匀,冰浴10分钟(宁短勿长）。1000p 分钟离心,上清转
7、至另一pendorf管中，加2.5倍体积的无水乙醇,混匀，-20放置小时。0000rp分钟离心，弃上清,加入70%乙醇0.5ml。10000p 5分钟离心，弃上清,干燥。加入0l TE使质粒溶解,酶切备用。 限制性内切酶消化取两个Eppendf管分别标记A、，依次加入下列物质构建两个反应体系。管:dH2O 6l 、0H bufer 2l、质粒DNA1l、ty1。管:dH2 14 、10M buffer 2l、0.%Sl、PC产物1l、Xba1l。37水浴4分钟。A管中加入1 Keo酶、lNTmi,室温30分钟，加50l酚氯仿-异戊醇，混匀，1000m 5分钟离心，取上层液转至另一ppndrf管
8、中,加00l无水乙醇、4乙酸钠，混匀，-0沉底小时。10000pm0分钟离心，弃上清，00l 7%乙醇洗涤一次，干燥。加入2 10M bufer、2 0.1%BSA、1l ba,7水浴5分钟。加50l酚-氯仿异戊醇,混匀，1000rpm 分钟离心，取上层液转至另一ppen管中,加100l无水乙醇、4乙酸钠，混匀,-2沉底1小时。10000m 10分钟离心，弃上清，100l 70%乙醇洗涤一次，干燥。加0lE进一步用于连接反应。B管中加50l酚氯仿-异戊醇，混匀，000pm 5分钟离心,取上层液转至另一ppendorf管中，加10l无水乙醇、4l乙酸钠，混匀，20沉底小时。1000rpm 10分
9、钟离心,弃上清,00 70%乙醇洗涤一次，干燥。加20l T进一步用于连接反应。连接在Eppenorf管中加入下列物质构建反应体系进行连接反应：H2O 95l、10T4 A连接酶buffer 2.5l、pKpL3质粒DNA 7l、I-8 PR产物l、T4 连接酶l。置12-16水浴反应过夜。水浴15分钟，灭活T4 连接酶,用于转化。 转化将无质粒大肠杆菌o2136接种于1ml LB培养基37培养3-小时。待OD600=0时转移至Epedorf管中，800p 分钟离心,弃上清。加200l 100mM Cl混匀，冰浴0分钟。加10l连接好的质粒DA，混匀，冰浴3分钟，37水浴2分钟,冰浴2分钟。加
10、入1m L培养基,37培养05小时。取出5l涂于LA培养皿上（含氨苄青霉素),7倒置培养过夜，检查转化菌是否生成(只有转化的细菌才能在平皿上生长)。 细胞因子的测定ES双抗体夹心法包被:将稀释好的包被抗体加入ELIA板,10l/孔,放置湿盒中， 小时。洗涤：加入洗涤液洗涤1分钟/次,共次。加样：加入待测样品、阴性对照及倍比稀释的标准品,100l/孔,放置湿盒中，37 0分钟。洗涤：同前。加酶标抗体:100/孔，00孔,放置湿盒中,3730分钟。洗涤:同前。加显色剂：液（MB，四甲基联苯胺）滴,液（H22）1滴，室温显色5-10分钟。终止反应:加中止液(2mo/ H2SO)。测OD值:酶标仪测4
11、0处OD值，以D值为横坐标，标准品浓度为纵坐标绘制标准曲线。2 结果 D琼脂糖凝胶电泳见图1。检查扩增结果，9组都见一致的扩增区带，PR产物与设计的228b相符,并无非特异性扩增，说明目的基因扩增成功。1 2 3 4 5 6 7 8 9图 DA琼脂糖凝胶电泳分析注：PCRPdcts：228b2.2 EIS双抗体夹心法检测L含量所测OD值和标准曲线见表1和图2。表1 0m处D值组Measurment count:1 Filter:4501235679101112A0.810.4850.4.654.440.641.7.241150055C0.35633093900.90.3641415.331.1
12、2.7540.86.618.9211370.66.841.39051.40.61E.8610.7471.691840.3580.750.3430.520.26.10.321118151.160.740.880.701.108.550.19G0.7765.1981.8764480.5406120990.9150.48H图2 ISA双抗体夹心法标准品OD值标准曲线根据标准品的浓度和试验所测D值，计算出待测样本的hL18浓度为0.4ng/ml。 讨论本实验首先通过PR技术扩增L-18DNA,反应结束后取出少量做琼脂糖凝胶电泳，根据图1的结果可以看出,引物的设计和PCR反应条件的设计是很成功的。而在R
13、反应中,引物的设计尤为重要。引物设计有条基本原则:首先引物与模板的序列要紧密互补;其次引物与引物之间避免形成稳定的二聚体或发夹结构；再次引物不能在模板的非目的位点引发ZL聚合反应(即错配）。具体实现这3条基本原则需要考虑到诸多因素。引物的长度一般为1530b,常用的是127bp，但不应大于27，因为过长会导致其延伸温度大于7,不适于aqDNA聚合酶进行反应1;引物序列在模板内应当没有较高相似性片段，尤其是端相似性较高的序列，否则容易导致错配1;末位碱基为A的错配效率明显高于其他3个碱基,因此应当避免在引物的3端使用碱基A；引物序列的GC含量一般为4%60%,过高或过低都不利于引发反应。上下游引物的GC含量不能相差太大; 引物所对应模板位置序列的T值在72左右可使复性条件最佳。m值的计算有多种方法,如按公式Tm=4（G+C)+2(（A); 引物二聚体及发夹结
