细胞免疫组化(SABC法)

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1、细胞免疫组化(SABC法)步步看:细胞冻存够了,且状态良好!咋们就开始做细胞免疫组化吧!开始做实验了,先看要准备些 什么吧!实验准备:实验用品:移液枪:1ml、200ul、10ul枪头:1ml、200ul、10ul枪头盒:1ml、200ul、10ulEP 管:1.5ml湿盒需要灭菌的东西:培养皿(可以是重复用的)、细胞爬片(多聚赖氨酸处理,并经过环氧 乙烷消毒)、常规细胞培养物品。试剂:细胞消化液、完全培养基、4%多聚赖氨酸、0.01M PBS(ph7.2-7.4)、3%H2O2 (现配)、 0.5%Txiton X-100、浓缩型SABC试剂盒(血清封闭液、二抗、三抗SABC)、苏木素、dd

2、H2O、 DAB显色试剂盒操作步骤:一、细胞爬片的制作1、细胞用消化液消化后,用完全培养基重悬(4-5ml)或者密度为1-5x106/ml2、在灭菌的培养皿中铺上3块细胞爬片(圆片),圆片间不要重叠3、取细胞悬液分别滴到圆片上,注意不要滴到圆片外,让细胞贴片30min左右4、30min后,在培养皿中补加完全培养液(轻微的加入,以免冲力将贴壁的细胞打下来), 放于37C,5%CO2培养箱中培养3h左右(让其贴壁更牢)。二、组化前处理1、取出培养皿,用PBS漂洗2x2min(PBS可以不灭菌)2、4%多聚甲醛处理(室温)20min;3、PBS 漂洗,3x2min;4、0.5%Txiton X-10

3、0 处理(室温)20min;5、PBS 漂洗,3x2min;6、3%H2O2 处理(室温)15min;7、PBS 漂洗,3x2min;三、组化1、血清封闭:试剂盒中的血清封闭液,37C,20min;2、取出甩干封闭液(不漂洗);一抗(1: 200)(PBS稀释),阴性对照用PBS代替一抗,37C1-2h 或 4C 过夜;3、PBS 漂洗,3x2min;4、二抗孵育:试剂盒中的生物素化.37C,20min;5、PBS 漂洗,3x2min;6、SABC 孵育:湿盒内 37C, 20min;7、PBS 漂洗,3x4min;8、DAB显色:DAB试剂盒中的A、B、C三种试剂,我是按照500ul蒸馏水中

4、各加4ul,混 匀。在镜下观察显色情况,在没有背景色的条件下可继续显色。一般在2-10min9、自来水冲洗;10、苏木素复染,15-30S;11、自来水冲洗;12、封片剂封片(有细胞一面对着载玻片),镜下观察若要长期保存片子,可以对爬片进行脱水处理:70%(1 次,1min)-80%(1 次,1min)-95%(1 次,1min)-无水乙醇(2x3min)-二甲苯(2x1min),观察是否彻底脱水,看观察片子放入二甲苯时,容器周围有白色雾状产生,若 有则说明脱水不彻底。可重新进行!得到结果:实验组中,细胞浆为棕黄色,细胞和为蓝紫色;阴性细胞中,只有核被染为蓝色, 胞浆无色!在此抱歉不能将图片上

5、传,还得用来发文章之用!在爬片时,圆片不好用镊子夹起,可在圆片之下垫上封口膜,这样操作起来即省事省时,又 节约试剂的用量和提高试剂的有效性。1将已消毒的20mm盖玻片置于90mm培养皿中,按2*104/ml的细胞密度将细胞接种于培 养皿中进行细胞爬片,5天后进行免疫细胞组织化学染色鉴定。2 PBS清洗标本3次各2 min。3 4%的多聚甲醛固定15分钟;【冷甲醇:丙酮1: 1】4空气干燥5min。5 PBS清洗标本3次各2 min。6 0.5%Triton X-100( DPBS 配)孵育 1 次 20 min。7 PBS清洗标本3次各2 min。8 3%H2O2 孵育 15 min。9 PB

6、S清洗标本3次各2 min。10封闭血清孵育(5%正常二抗血清DPBS液)20min。11 一抗孵育(PBS配,滴度1: 200,湿盒)4OC过夜或 37OC 60 min。阴性对照最好用一抗来源血清,否则用PBS液12 PBS清洗标本3次各5 min。13二抗工作液孵育pv6001 (湿盒)37OC 30 min。14 PBS清洗标本5次各2 min。15、DAB显色(避光,镜下观察至棕色)约1015min。17、 蒸馏水或自来水洗1次5 min。(可放六孔板内,再将孔板放在饭盒等内,自来水下冲 洗)18、苏木素复染10min。19、自来水洗5min。20、树胶封片。贴壁细胞需要做免疫组化时,可以在培养皿里放入盖玻片,让细胞长在上面后,在取出 来进行实验。需要注意的是:取出培养好细胞的盖玻片后,PBS洗两次后,室温晾干用PFA 或丙酮室温或4度固定都可以,1015分钟。之后可按组化常规方法进行。封片时将有细 胞的面向下盖在载玻片上即可。另外,用丙酮固定细胞的同时即对细胞膜进行了打孔的步骤,如果用PFA进行固定,则 需要再使用打孔剂打孔(细胞内表达)。使用过氧化氢去除内源性过氧化物酶时,细胞要比 石蜡切片的组织反应强烈,偶尔会掉片。

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