细胞培养实验集合

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1、实验一 培养基的配制及细胞培养的条件培养基的特性细胞生存的环境与条件1、温度条件（37 0.5）2、pH 条件 ( 7.2-7.4)3、气体条件4、水的质量（三蒸）5、渗透压6、营养条件7、无菌条件C二、培养基的分类1、平衡盐液2、天然培养基（小牛血清、胚胎液）3、合成培养基（化学成分清楚）三、RPMI1640培养基的配制1、RPMI1640 10 g、2、丙酮酸钠.0.11 g3、Hepes （羟乙基哌碃乙硫磺酸）5.925 g磁4、NaHC03 2 g5、三蒸水1000 mL,四、过滤出菌仪器：不锈钢正压滤器材料：纤维素微孔虑膜（0.22 mm孔径）装好后消毒五、完全培养基的配制RPMI

2、1640培养液 85 mL小牛血清10 mL谷氨酰氨1 mL抗菌素（青、链霉素） 1万单位 1 mL实验二动物细胞培养细胞培养是指从生物体内取出组织或细胞，在体外模拟体内生理环境，在无菌、适当温度和 一定营养条件下，使之生存、生长和繁殖，并维持其结构和功能的方法。由于体外培养的细胞其 结构和功能接近体内情况，便于使用各种技术和方法进行研究，并能在较长时间内直接观察细胞 生长、发育、分化过程中的形态和功能变化，而且可同时提供大量生物学性状相似的细胞作为研 究对象。所以细胞培养已经成为现代医学研究中一项非常重要的技术。细胞培养不但是一门技术，也是一门科学，有它的基本理论、基本知识、和基本方法。一、

3、实验目的1. 使学生在细胞培养方面得到一些初步的感性知识，了解动物细胞培养的基本操作过程；2. 学习动物细胞原代培养和传代培养的基本方法，掌握动物细胞培养中的无菌操作技术， 以及培养细胞的形态分类特点；3. 以所培养细胞为材料，了解细胞冻存的几种简易方法并通过实验掌握其中的一种方法；4. 以所培养细胞为材料，学习动物细胞融合的几种方法并掌握其中的一种方法。二、实验条件本实验在细胞工程实验室完成。1、需要提供CO培养箱，细胞融合仪，冷冻仪，研究用成像显微镜，体视成像显微镜，普2 通显微镜，生化培养箱，全自动高压灭菌锅，水浴锅，超声波清洗仪，超净工作台，真空泵，冷 冻离心机，干燥箱，剪刀，镊子，液

4、氮罐，纯水器，低温冰箱，普通冰箱等。2、各种规格培养瓶、离心管，吸水纸，各种试剂瓶，培养皿3、生化试剂：胰蛋白酶，胶元蛋白酶，M9培养基，DMEM, RPMI164培养基，Ml培养基， 牛尾胶元，肝素，秋水仙素，PHA，小牛血清，青霉素，链霉素，EDTA, HEPES，Hanks液，Earl e 液，荧光染料，快绿，谷氨酰胺，聚乙二醇，4、实验动物：小白鼠，兔子三、实验要求1、根据细胞工程理论课所学知识，就以上实验目的设计出实验方案（包括所选用材料、实 验技术、方法）；2、实验方案须交指导教师修改，然后开始实验；3、实验过程中要严格遵守操作规程，独立完成。4、设计实验方案前要多查阅文献资料，根

5、据实际情况来选材、设计，尽量做到就地取材。5、实验完成后，要认真分析实验结果，总结实验成败的因素，写出详细的实验报告。四、实验说明1、本实验的实验内容包括以下几点：1. 动物组织细胞形态观察与识别；2. 动物细胞的贴 壁培养；3. 动物细胞的悬浮培养；4. 动物组织细胞的原代和传代培养；5. 动物细胞的冷冻保 存；6. 动物细胞的融合。2、要使细胞在体外长期生存，必须模拟体内环境，供给细胞存活所必须的条件，如：水、 无机盐、氨基酸、维生素、葡萄糖、生长因子等，还要受到温度、渗透压等多种因素的影响。细 胞培养用品的清洗、培养用液的配制、除菌等均有严格的要求，特别是无菌操作，是细胞培养成 败的关键

6、。3、直接从生物体内获取细胞进行首次培养称为原代培养，当培养的细胞增殖达到一定密度 后，需要做再培养，即将培养的细胞分散后，以一定的比率从一个容器转移到另一个容器中扩大 培养，为传代培养。传代培养的累积次数就是细胞代数。4、大多数细胞在体外培养时能贴附在支持物表面生长，称贴附型生长细胞，少数种类的细 胞在培养时不贴附在支持物表面，而呈悬浮状态生长，称为悬浮型生长细胞。5、在细胞培养过程中，细胞的传代及日常维持工作需要大量的耗费，而且随着传代次数的 增加，体外培养细胞的生物特性会慢慢发生变化，因此需要对培养细胞进行及时的冻存，必要的 时候在复苏。6、两个以上细胞合并成一个双核或多核细胞，成为细胞

7、融合。五、注意事项1、每班成立一个班长负责制的开放实验管理小组，成员为每小组的组长，负责安排相关同 学配合教师完成以下工作：（1）实验前领取实验试剂和器具；（2）实验过程中实验室的水电、 药品安全、仪器使用和登记情况、清洁卫生；（3 实验完成后整理实验室。2、实验过程中要严格遵守操作规程，独立完成。做到爱护仪器、节约材料和药品。实验完毕应及时清洁整理用过的实验仪器和用品。六、思考题1、简述体外培养细胞的生存条件。2、在细胞培养中如何防止污染？3、为什么培养细胞长成致密单层后要进行传代培养？4、简述贴附型生长细胞和悬浮型生长细胞传代培养的主要方法和步骤。5、进行细胞融合时要注意哪些问题？细胞融合

8、率受哪些因素的影响？6、冷冻过程中为什么要用慢速冷冻的方法？实验三动物细胞连续传代培养（SP2/0细胞）一、实验目的：1、为细胞融合准备 SP2/0 小鼠骨髓瘤细胞；2、杂交瘤细胞的扩大培养（种腹水），或传代培养。二、实验原理：小鼠骨髓效力细胞株（NSI, SP2/0）和杂交瘤细胞均具有无限生长繁殖的能 力，它们都属于半贴壁细胞，不用胰蛋白酶或EDTA消化液，只需轻轻冲洗瓶 壁上的细胞便可脱落。因而可以利用这些特性对这类细胞进行连续传代培养,以 为实验提供生长旺盛的细胞（对数生长期的细胞）。三、实验材料：SP2/0 细胞（或杂交瘤细胞）CO2培养箱、细胞培养瓶（25、50、100毫升）、弯头滴

9、管、消毒用套筒（玻 璃或铜质）、吸头、RPMI-1640完全培养基、倒置显微镜、试管架、酒精灯、灭 菌高压锅。四、实验步骤：1、复苏的或转瓶的传代细胞，使细胞浓度大约为5 X 104/毫升，置37C5% co2培养箱中培养。2、培养48 小时后，可见部分细胞贴壁生长，而部分细胞呈漂浮状态，可用 滴管吸去漂浮的细胞，加入少量新鲜培养基继续培养24小时以上。3、若细胞生长过密，则需及时冲下并吸出部分细胞，或将吸出的细胞转瓶 扩大培养，如果不是这样处理，细胞很易出现衰老、死亡现象，对于杂交瘤来讲， 这样更易诱发阳性克隆丢失可能性。4、用于细胞融合的骨髓细胞，必须在生长繁殖的对数期（约105细胞/毫升

10、）， 而且细胞形态规则要一致（圆而亮，有一定的立体感），机能要活跃，活细胞数 在9095%以上。要得到这种细胞，其培养技巧在于，在融合前24小时，将生 长良好的细胞全部自瓶壁冲下来，并除去1/2或更多的细胞，加入新鲜培养液令 细胞重新贴壁分裂增繁。5、作为长期在体外传代培养的细胞，为减少工作量，可采用 810%小牛血清的培养基，这样细胞的繁殖速度亦慢，一般可间隔3天更换一次培养液。6、本试验要求各组将细胞自小瓶转入中瓶再转入较大的培养瓶中生长，并 用对数增长期的细胞用于冻存和复苏实验（见实验六）。五、结果观察：1、细胞传代前后的生长状态及速度的观察；2、细胞转瓶后生长情况观察；3、了解生长良好

11、，一般及较差细胞的显微镜下观察；4、传代细胞培养的体会。六、注意事项：1、连续细胞传代培养更应注意无菌操作；2、传代时机对于细胞生长的状况及速度十分重要，尤其要注意不能等细胞出现老化后再传代，那样做一般结果并不如愿；3、传代转瓶时细胞量的取舍主要根据细胞量的多少，生长条件优劣以及个 人实践经验而决定；4、用于冻存、融合、传代的细胞都要求是处于对数增长期的细胞，不能勉 强 为之。实验四淋巴细胞杂交瘤的制备一、实验目的1、系统了解淋巴细胞杂交瘤实验技术的全部过程； 2、学会观察与判别融合细胞的出现，并计算融合率。二、实验原理： 小鼠骨髓瘤可以在体外培养液中生存并大量繁殖。经过用某种抗原免疫的小 鼠

12、及淋巴细胞能分泌某种抗体，但小鼠的B淋巴细胞在一般培养某中不易存活。如将小鼠的骨髓瘤细胞与分泌霜种抗体的B淋巴细胞在融合因子（聚乙二 醇，PEG）作用下产生融合，则融合的细胞既具有肿瘤细胞易分裂增殖的特性， 又具有B淋巴细胞分泌特异性抗体的能力，在HAT选择培养基中可以选择得到 杂交细胞。这种融合的被称为淋巴细胞杂交瘤的细胞可以在体外培养液中大量繁 殖生长，从培养液上清中可以收集到大量某B淋巴细胞产物一一单克隆抗体。三、实验材料： 免疫的BALB/小鼠，SP2/0骨髓瘤细胞株，CO2培养箱 超净工作台倒置显微镜光学显微镜恒温水箱 计数板、计数器、盖玻片； 离心机手提式自封消毒锅 弯头滴管吸量管

13、（1.0、0、5.0 毫升） 注射器（5 毫升， 10 毫升） 针头（7#）细胞培养瓶24孔、96 孔培养板（天津产或进口） 酒精灯120 目钢丝网9cm平皿50ml 带盖塑料离心管100 毫升三角瓶、青毒素小瓶 烧杯（100， 500， 1000 毫升） 微滤器1000 毫升正压不锈钢滤器 微孔滤膜眼科剪、镊 脱脂棉、纱布、胶布、卫生卷纸HAT培养基HT 培养基 无血清培养基15%小牛血清培养基 小牛血清乙醇（AR,工业纯）CPBS四、培养基与试剂的配制：1、RPMI-1640 培养基的配制；RPMI-1640 粉10.4g丙酮酸钠0.11gHepes5.925g三蒸水1000ml磁力搅拦器

14、搅拦3小时，溶解后过滤除菌，在4C中保存。2、200mML-谷氨酰胺的配制：L-谷氨酰胺1.461g三蒸水100ml深解后，过滤除菌，分装小瓶，每瓶1ml，在-20C保存。4.5%碳酸氢钠（N HCO3）配制a3NaHCO35g三蒸水100ml8磅高压灭菌15分钟，在4C保存。如分装小瓶，每瓶4.2ml。5、次黄嘌吟及胞腺嘧啶核苷（HT） 100倍母液配制：次黄嘌吟（Hypoxanthine，H） 10一2m68.05mg胞腺嘧啶核苷（Thymidine,T） 16X10-3m19.4mg三蒸水50ml在4550C水浴中溶解，过滤除菌，分装小试管中，每管15ml，在-20C 保存。6、氨基碟吟

15、（A） 4X 10-5m1.76mg三蒸水90mlIN 氢氧化钠0.5ml溶解后，加入IN盐酸0.5ml中和，补充蒸馏水至 100ml过滤除菌，分装小试管内，每管 15ml,在-20 C 保存。7、无血清 RPMI-1640100mlL-谷氨酰胺200nM (0.2)1.0ml抗菌素（青、链霉素各 1 万单位）1.0ml5%碳酸氢钠4.2ml8、RPMI-1640 完全培养基配制RPMI-1640完全培养液100mlL-谷氨酰胺 200mM (0.2m)1.0ml青、链霉素（各1万单位/ml）1.0ml5%碳酸钠4.2ml小牛血清（灭活）15ml9、HAT 培养基的配制：RPMI-1640完全培养基100ml100倍HT母液1.0ml100倍A母液0.8ml10、HT 培养基的配制RPMI-1640