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1、色谱法基本理论一、分类if气相色谱（GC）按流动相分 液相色谱（LC）超临界流体色谱（SFC）吸附色潜分西已色潜离子立换色谱扫丘I4S使潜总分类：1 / 15W卫怕乍.4*2P* 丨 亠憑蚪IBdc舉7kL.6匚.-二找哲ij* 亠 PIJIT*卫? my wt:-C1一 sw 鏗冒rII苦 Eul *纟疋电-毎1.色谱基础线（1）基线 在实验操作条件下，色谱柱后没有样品组分流出时的流出曲线称为基线，稳定的 基线应该是一条水平直线，反映了随时间变化的检测器系统噪声。（2）峰高色谱峰顶点与基线之间的垂直距离，以（h）表示。2.区域宽度用于衡量柱效率及反映色谱操作条件的动力学因素。（1 ）标准偏差
2、6即 0.607 倍峰高处色谱峰宽的一半。（ 2 ）半峰宽 W1/2即峰高一半处对应的峰宽。它与标准偏差的关系为Wi/2=2.355 63基线宽度W即色谱峰两侧拐点上的切线在基线上截距间的距离。它与标准偏差6的关系是W= 4 6=1.699 W1/23.保留时间（ 1 ）死时间 tM不被固定相吸附或溶解的物质进入色谱柱时，从进样到出现（第一个峰）峰极大值所需的时间称为死时间，它正比于色谱柱的空隙体积。其流动速度将与流动相流动速度相近。测定流动相平均线速Q时，可用柱长L与t 的比值计算，即Mu = L/tM(2)保留时间 tR 试样从进样到柱后出现(第二个峰)峰极大点时所经过的时间，称为保留时间
3、。(3) 调整保留时间t R某组分的保留时间扣除死时间后，称为该组分的调整保留时间，即t = t tR R M由于组分在色谱柱中的保留时间 t 包含了组分随流动相通过柱子所需的时间R和组分在固定相中滞留所须的时间，所以t实际上是组分在固定相中保留的总时R间。保留时间是色谱法定性的基本依据。4.保留体积( 1 )死体积 VM指色谱柱在填充后，柱管内固定相颗粒间所剩留的空间、色谱仪中管路和连接头 间的空间以及检测器的空间的总和。当后两项很小可忽略不计时，死体积可由死 时间与色谱柱出口的载气流速Fc (cm3min-1 )计算。即VM = 5Fc式中Fc为扣除饱和水蒸气压并经温度校正的流速。仅适用于
4、气相色谱，不适用 于液相色谱。(2)保留体积 VR 指从进样开始到被测组分在柱后出现浓度极大点时所通过的流动相的体积。保留 时间与保留体积关系：即Vr= tR Fc(3)调整保留体积V，R某组分的保留体积扣除死体积后，称为该组分的调整保留体积。V = V - V= t FR R M Rc用保留体积表示保留值5.相对保值 ri某组分2的调整保留值与组分1的调整保留值之比，称为相对保留值。r = t / t = V / V 2,1 R2 R1 R2 R1由于相对保留值只与柱温及固定相性质有关，而与柱径、柱长、填充情况及流动相流速无关，因此，它在色谱法中，特别是在气相色谱法中，广泛用作定性的依据。6
5、.拖尾因子用于衡量色谱峰的对称性。 T 在 0.951.05 之间时，此峰即为对称峰。 色谱曲线的意义：(i) 根据色谱峰的个数，可以判断样品中所含 组分的最少个数；(ii) 根据色谱峰的保留值，可以进行定性分析；(iii) 根据色谱峰的面积或峰高，可以进行定量分析；（iv）色谱峰的保留值及其区域宽度，是评价色谱柱分离效能的依据；（v）色谱峰两峰间的距离，是评价固定相（或流动相）选择是否合适的依据。三、各项指数（1）分配系数在一定温度和压力下，组分在固定相和流动相之间分配达平衡时的浓度之比值即心溶质在固定相中的浓度/溶质在流动相中的浓度=C /C（g/ml）sm它仅与两个变量有关：固定相和温度
6、。组分K值小的在流动相中浓度大，先流出色谱柱。2）保留因子保留因子又称分配比，它是指在一定温度和压力下，组分在两相间分配达平衡时分配在固定相和流动相中的物质的量比。即k= 组分在固定相中的物质的量 / 组分在流动相中的物质的量= n /nsm或= m /mm 表示质量sm k值越大，说明组分在固定相中的量越多，相当于柱的容量大。它是衡量色 谱柱对被分离组分保留能力的重要参数。 k 值也决定于组分及固定相热力学 性质。 分配比k值可直接从色谱图中测得。k = (t - t ) / t = t / t = V / VR M M R M R 0 组分保留因子越大，保留时间越长。 分配系数 K 与分配
7、比 k 的关系K = k V/V =k pSM其中B称为相比，它是反映各种色谱柱柱型特点的又一个参数。例如，对填充柱,其B值一般为6-35 ；对毛细管柱，其B值为60-600。(3)保留因子与保留比R，的关系对于一个真正的动态平衡，一个样品分子在流动相中出现的概率。R=溶质在流动相中分子数/溶质分子总数R =1,溶质全部随流动相移动。R =0,溶质全部固定在固定相。有公式云：tR=tR =tM(1+k)故 保留因子k越大，或保留比R越小，溶质保留时间tR越长。(4)分离条件如果两组分的K或k值相等，则a=1，两个组分的色谱峰必将重合，说明分不开。两组分的K或k值相差越大，则分离得越好。因此两组
8、分具有不同的分配系数是色谱分离的先决条件。塔板理论1. 理论假设 在柱内一小段长度 H 内，组分可以在两相间迅速达到平衡。这一小段柱长称 为理论塔板髙度H。 以气相色谱为例，载气进入色谱柱不是连续进行的，而是脉动式，每次进气为个塔板tti(AVm )。 所有组分开始时存在于第0号塔板上，而且试样沿轴(纵)向扩散可忽略 。 分配系数在所有塔板上是常数，与组分在某一塔板上的量无关。2. 相关方程I 理论塔板数与柱效于根长为 L 的色谱柱，溶质平衡的次数应为n = L / Hn 称为理论塔板数。色谱柱的柱效随理论塔板数n的增加而增加，随板高H的增大而减小。II. n与半峰宽及峰底宽的关系式为:n =
9、 5.54(t / Y )2 = 16 (t / Y)2 R 1/2 R式中t与Y ( Y )应采用同一单位(时间或距离)从公式可以看出，在t 定R 1/2 R时，如果色谱峰很窄，则说明n越大，H越小，柱效能越髙。(Y :半峰宽)1/2III 最大浓度Cmax和C0进样浓度max=CC0=A=1-065xW1/2xhmaxA 为色谱峰面积。IV.由上面公式计算出来的的n和H值有时并不能充分地反映色谱柱的分离效 能，因为采用t计算时，没有扣除死时间t ,所以常用有效塔板数n表示柱效：RM有效n = 5.54(t / Y )2有效R 1/2=16 ( t，/ Y)2有效板高：RH = L / n3
10、.意义有效有效 溶质在柱中的平衡次数，即理论塔板数n大于50时，可得到基本对称的峰形 曲线。在色谱柱中，n值一般很大，如气相色谱柱的n约为103 -106，因而这时 的流出曲线可趋近于正态分布曲线。 当样品进入色谱柱后，只要各组分在两相间的分配系数有微小差异，经过反复 多次的分配平衡后，仍可获得良好的分离。 有效的解释了曲线的形状、浓度极大点的位置及计算评价柱效。4.小结1这一方程看出影响柱效率的因素是理论板数n,其值越大，色谱峰月窄，分离 效果越好；2. 论上得到了描述色谱流出曲线的方程,通过该方程可以预测具有不同分配系数 K的两种物质在塔板数为n的色谱柱上分离的情况；五、速率理论1.主要引
11、入塔板的理论对色谱柱中存在的各项阻力引起的各组分流出滞后造成 峰型变化进行解释。2. 该理论模型对气相、液相色谱都适用。3. van Deemter 方程的数学简化式为H = A + B / u + C u式中u为流动相的线速度；A、B、C、为常数，分别代表涡流扩散系数、分子扩 散项系数、传质阻力项系数。为了使得 H 最小，柱效最高，需要使得 u 最佳。Hmin=A+2分子扩散项和传质阻力项对板高的贡献/较低线速时，分子扩散项起主要作用；较高线速时，传质阻力项起主要作 用；其中流动相传质阻力项对板高的贡献几乎是一个定值。/在高线速度时，固定相传质阻力项成为影响板高的主要因素，随着速度增 高，板
12、高值越来越大，柱效急剧下降。4. 涡流扩散项 A在填充色谱柱中，当组分随流动相向柱出口迁移时，流动相由于受到固定相 颗粒障碍，不断改变流动方向，使组分分子在前进中形成紊乱的类似涡流的流动 故称涡流扩散。 因为颗粒的阻滞使得色谱柱中有许多不同长度的路径，使得流动相到达时间有擦 差异，引起峰变宽。A = 2 入dpA与填充物的平均直径dp的大小和填充不规则因子入有关。对于空心毛细管，不存在涡流扩散，因此 A = 0。5. 分子扩散项 B / u纵向分子扩散是由浓度梯度造成的。组分从柱入口加入，其浓度分布的构型呈“塞 子 ” 状。它随着流动相向前推进，由于存在浓度梯度， “ 塞子 ”必然自发的向前和
13、 向后扩散，造成谱带展宽。分子扩散项系数为B = 2y Dg式中：Y弯曲因子，填充柱Y 1空心柱Y = 1D 组分在流动相中的扩散系数m扩散系数Dg与组份的性质、载气性质、温度、压力有关。由于组分在液相中的扩散系数只有气体中的 1/105，因此在液相色谱中 B 可以忽 略。为减少此因素干扰，提高柱效，可以采用较高的载气流速。使用相对分子质量 大的载气，控制较低的柱温。6.传质阻力项 Cu（1）气相色谱传质阻力系数C包括气相传质阻力系数C和液相传质阻力系数C两项, g1即C = Cg+ Cg1I 气相传质过程是指试样组分从气相移动到固定相表面的过程。在这个内部过程中存在两种情况: 液体进入两相界
14、面后还未出来气体已经过去了。 液体还没进入两相界面就被气体带跑了。这样使得试样在两相界面上不能瞬间达到分配平衡，引起滞后现象，从而使色谱峰变宽。气相传质阻力系数C , k为保留因子。g故：采用粒度小的填充物和相对分子质量小的气体（如氢气）做载气，可使 C g减小，提高柱效。II.液相传质过程是指试样组分从固定相的气/液界面移动到液相内部，并发生质量交换，达到分配平衡。这个过程主要是因为需要一定的时间来完成，所以导致了色谱变宽。固定相的液膜厚度 df。采用比表面积较大的载体来降低液膜厚度。但比表面太大，由于吸附造成拖尾峰，也不利于分离。控制适宜的柱温。（2）液液分配色谱对于液液分配色谱，传质阻力系数（C） 包含流动相传质阻力系数（Cm）和固定相传质系数（Cs ）,即C = Cm + Cs其中Cm又包含流动的流动相中的传质阻力和滞留的流动相中的传质阻力。该式与气液色谱速率方程的形式基本一致，主要区别在液液色谱中纵向扩散项可忽略不计，影响柱效的
