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1、第七章固定化酶与固定化细胞技术12本章主要内容：第一节 概述第二节 固定化酶与固定化细胞的制备第三节 固定化酶的性质及其影响因素第四节 固定化酶(细胞)的应用23什么是固定化酶？第一节 概 述34固定化酶(Immobilized Enzyme)是20世纪60年代发展起来的一项新技术。它是通过物理的或化学的手段，将酶束缚于水不溶的载体上，或将酶柬缚在 一定的空间内，限制酶分子的自由流动，但能使酶充分发挥催化作用；过去曾称其为水 不溶酶或固相酶。 1971 年第一届国际酶工程会上正式建议采用固定化酶的名称。从 60 年代起，固定化酶的研究发展很快，起初人们把注意力集中在酶的固定 化方法研究上，近年
2、来，不但固定化方法和载体开发有了长足发展，并且已转向它在工 业、医药、环保、能源开发以及理论研究等方面的应用研究。固定化酶的发展：45固定化酶与固定化细胞的优缺点固定化酶的优点：(1) 极易将固定化酶与底物、产物分开；产物溶液中没有酶的残留，简化了提纯工 艺；(2) 可以在较长时间内反复使用，有利于工艺的连续化、管道化；(3) 酶反应过程可以严格控制，有利于工艺自动化和微电脑化；(4) 在绝大多数情况下酶的稳定性得以提高；(5) 较能适应于多酶反应；(6) 酶的使用效率提高，产物得率提高，产品质量有保障，成本低。56 固定化酶的缺点：(1) 固定化时酶的活力有所损失。同时也增加了固定化的成本，
3、使工厂初期投资增 大；(2) 比较适应水溶性底物和小分子底物；(3) 与完整细胞比较，不适于多酶反应，特别是需要辅因子的反应，同时对胞内酶 需经分离后，才能固定化。67(1) 省去了酶的分离；为多酶系统，无须辅因子再生；(2) 细胞生长快、数量多、反应快；(3) 可以连续发酵，而且产物提取前不用分离去细胞，能一边排出发酵液，一边进 行培养，排除了产物抑制和消耗；(4) 保持酶在细胞内的原始状况，增加了酶的稳定、特别是对污染因子的抵抗力增 加。固定化细胞的优点78(1) 必须保持菌体的完整，防止菌体自溶，否则，将影响产品纯度；(2) 必须防止细胞内蛋白酶对所需酶的分解，同时，需抑制胞内其他酶的活
4、性、 阻止副产物的形成；(3) 细胞膜、壁会阻碍底物渗透和扩散。固定化细胞同时也存在些缺点：89一、 酶的固定化方法酶的固定化方法有：吸附法；共价键结合法；交联法；包埋法。第二节 固定化酶与固定化细胞的制备交联10111. 吸附法 吸附法分为物理吸附法和离子交换吸附法。(1) 物理吸附法：通过氢键、疏水作用和n电子亲和力等物理作用，将酶固定于水 不溶载体上。从而制成固定化酶。常用的载体有： 有机载体：纤维素、骨胶原、火棉胶及面筋、淀粉等。比如用纤维素作为吸 附剂，用膨润的玻璃纸或胶棉膜吸附木瓜蛋白酶、碱性磷酸脂酶、 6磷酸葡萄糖脱氢 酶。吸附后在载体表面形成单分子层，吸附蛋白能力约 70mg/
5、cm2。1112 无机载体：氧化铅、皂土、白土、高岭土、多孔玻璃、二氧化钛等。例如：用多孔硅为载体吸附米曲酶和枯草杆菌的淀粉酶以及黑曲霉的糖化酶，在 45C进行固定化，用高浓度的底物进行连续反应，半衰期分别为14、35、60d。无机载体的吸附容量较低、而且酶容易脱落。1213(2) 离子交换吸附法:是将酶与含有离予交换基的水不溶载体相结合而达到固定化的一种方法。酶吸 附较牢，在工业上颇具广泛的用途。常用的载体有：阴离子交换剂：如二乙基氨基乙基(DEAE)-纤维素、混合胺类(ECTEDLA-纤维素、 四乙氨基乙基(TEAE)-纤维素、DEAE-葡聚糖凝胶等。阳离子交换剂：如羧甲基(CM)-纤维素
6、、纤维素柠檬酸盐、Amberlite CG50、IRC-50、 IR-200、 Dowex-50 等。14例：DEAE-Sephadex固定化氨基酰化酶将 DEAE-SephadexA25 充分溶胀，用 05mol/LNa0H 和水洗涤后，加入 pH7.07.5的米曲霉3042粗酶液（活力为25umol/ml h）,充分混合（1g湿重载体加60ml 酶液），于低温下搅拌过夜后，吸去上清液，再用蒸馏水和0.15mol/L醋酸钠水溶液洗涤 固定化酶，置4C备用。固定化酶活力回收5060%，水解乙酰一DLA1a活力为 600-800umol/g h 湿固定化酶。氨基酰化酶也可固定于 D EA E 纤
7、维素。此外，DEAE-纤维素吸附的a-淀粉酶、蔗糖酶已作为商品固定化酶。1415吸附法制备固定化酶操作简单，可充分选择不同电荷、不同形状的载体，吸附 过程可以同时纯化酶，固定化酶在使用过程失活后可重新活化，同时，载体可以回收再 利用。但由于有些机理不十分明了，在给酶量、吸附程度与固定化酶活力回收的关系 不可预见性大，同时由于吸附法制备的固定化酶易脱落，影响产物纯度和酶的操作为稳 定性。15162. 包埋法 定义：将酶或含酶菌体包埋在各种多孔载体中，使酶固定化的方法称为包埋法。包埋法操作简单，由于酶分子只被包埋，未进行化学反应，可以制得较高 活力的固定化酶。对大多数酶、粗酶制剂甚至完整的微生物细
8、胞都是适用的。但是，只 有小分子底物和产物可以通过凝胶网络，而对大分子底物不适宜；同时，凝胶网络对物 质扩散的阻力导致固定化酶动力学行为的变化、活力降低。包埋法常用凝胶包埋法和微囊化法。1617（1）凝胶包埋法 是将酶分子包埋在凝胶细微网格中，制成一定形状的固定化酶。也称为网格 型包埋法。 聚丙烯酰胺凝胶包埋法 聚丙烯酰胺包埋法的缺点是酶容易漏失，以低分子量蛋白质为甚，如果调整交联剂浓度与交联程度可以得到克服。18聚丙烯酰胺凝胶包埋法的一般制备过程：将1ml溶于适当缓冲液的酶溶液加入含有750mg丙烯酰胺（单体）和40mgN, N-甲叉双丙烯酰胺（交联剂）的3ml溶液中，再加0.5ml 15%
9、的二甲氨基丙腈（加速剂）， 同时，加入1%过硫酸钾（引发剂），混合，于25 C保温10min,便得含酶凝胶。将凝胶粉碎，制得不规则的颗粒，于低温储存或冷冻干燥。 若制备珠状固定化酶，可以在聚合反应开始时，立即转入到疏水相（一种 乳化剂，与水相有相同密度）的有机溶液中，使分散成含酶的珠状凝胶。1819 辐射包埋法。酶溶于纯单体水溶液、单体加合物水溶液或纯聚合物溶液中，在常温或低温下， 用x-射线、Y-射线或电子束辐照，可得到包埋酶的亲水凝胶。1973年H. Maeda等用聚乙烯水溶液辐照包埋了多种酶。这些被固定的生 物物质主要分布在载体表面层区域，固定化产物表面具有生物活性，曾称这种方法为粘 附
10、法。这种方法可粘附酶、叶绿素、病毒等，长期使用后仍有较高的活性。如用X-射线引发聚丙烯酰胺聚合，可以固定胰蛋白酶。1920 其他凝胶包埋法。a. 淀粉凝胶包埋法： 将氨基甲酸乙酯的泡沫垫浸入温热的淀粉溶液和乙酰胆碱脂酶的混合物中，再 经冷却、干燥，便制得固定化乙酰胆碱脂酶。为增强机械强度和重新水合可加入一定量 的甘油。b. 胶原包埋法（即大分子络合法）：胶原有纤维性，易成膜，能在生理 pH 下自发的聚焦成束，胶束末端可以通 过多种次级键与酶分子相互作用，通过酶和胶原分子形成网架而将酶固定化。其制备方法极为简单：将酶加到胶原悬浮液中、铺膜、干燥即得固定化酶。或 者经过透析的酶和胶原混合，插入电极
11、，酶-胶原复合物便在电极上沉淀。20d. 卡拉胶包埋法：卡拉胶（K-Carrageenin）是由角叉菜（鹿角菜）中提取的一种多糖。包埋 酶的方法为：将100g酶在3750 溶于水中，再将1.7g卡拉胶在4060 C溶于34ml 生理盐水中，二者混合后冷却至10C，所成凝胶浸在0.3mol/L KCl溶液中硬化，作成 适当大小的颗粒，即为固定化酶。c. 海藻酸钙包埋法 称取一定量的海藻酸钠配成水溶液，经杀菌冷却后，与一定体积的酶或 细胞悬浮液混合均匀，然后用注射器或滴管将冷悬液滴入一定浓度的凝固浴中（常用 CaCl2 溶液），形成球状固定化酶（或细胞）。2122e. 天然血纤维包埋法：血纤维不会
12、引起抗体形成，且无毒。在柠檬酸缓冲液中使酶和血纤蛋白原及 凝血酶混合、便制得血纤蛋白包埋的固定化酶。f. 大豆蛋白包埋法：含葡萄糖异构酶的链霉菌菌株与大豆蛋白溶液混合，在60C用碳酸镁处理使 其凝结，过滤、制球，干燥后用戊二醛和六甲叉二胺处理，硬化，从而制得固定化葡萄 糖异构酶。2223（2）微囊型包埋法 是将酶包埋在各种高分子聚合物制成的小球（微囊）内，制成固定化酶。由 于固定化形成的酶小球直径一般只有几微米至几百微米，所以也称为微囊化法。微囊一般直径约1100um,膜厚约100nm，膜上孔径约3.6nm,表面积与体 积之比极大，物质能很快达到平衡，能有效的包埋许多种酶。同时、可用不同类型、
13、不 同浓度的酶、细胞提取物或细胞，不同组成和含量的膜包裹组建成人工细胞 . 因此， 此法在医疗上极为有用。例如：固定化天门冬酰胺酶（治疗白血病）就是用这种方法制成的微胶囊。微胶囊的制备方法有多种。 界面沉淀法 这是一种简单的物理法，它是利用某些高聚物在水相和有机相的界面上溶解度 较低而形成的皮膜将酶包埋。高聚物有：硝酸纤维素、聚苯乙烯和聚甲基丙烯酸甲酯等。2425 界面聚合法 是用化学手段制备微囊的方法。利用油水界面上发生聚合反应形成聚合体而 将酶包裹起来。制备方法一般是： 将酶溶液与亲水单体（如乙二醇）用一种水不溶混的有机溶剂制成乳化液，再 将溶于同一有机溶剂疏水单体（如多异氰酸）溶液在搅拌
14、下加入到上述乳化液，便在乳化 液中的水相和有机溶剂之间的界面发生聚合。这样水相中酶便包埋在聚合体（聚脲）膜内2526例如：用含酶的 10血红蛋白水溶液与己甲叉二胺的水溶液混合，立即在 1的氯 仿-环已烷中分散乳化,加入癸二酰氯（有机相）后，便在油-水界面发生聚合反应，弃除 上清液，加入Tween-20去乳化，洗除有机溶剂，除去未聚合单体后，转入水相，制得固 定化酶。2627例如：将卵磷脂、胆甾醇和二鲸腊磷酯按7：2：1 溶于氯仿中，再加入酶液，混合 物在旋转蒸发器中、在氮气下32C转动乳化，然后在室温下保持2h，再在氮气气流中， 4C用超声波处理10s，在室温下保持2h,过Sepharose
15、6B柱，收集脂质体，离心分离 脂质体；所得球粒悬浮于缓冲液中，继续超声波处理，并过Sepharose 6B 柱,可得含酶 的微囊。 脂质体包埋法近年来采用双层脂质体形成极细球粒包埋酶。283. 共价键结合法共价键结合法是酶蛋白的侧链基团和载休表面上的功能基团之间形成共价 键而固定的方法。特点：酶与载体结合牢固，酶不易脱落，但反应条件较激烈，酶易失活，同 时，制作手续亦较繁琐。共价键结合法制备固定化酶的“通式”：首先载体上引进活泼基团关键然后活化该活泼基团最后此活泼基团再与酶分子上某一基团形成共价键2829酶分子和载体连接的功能基团 酶蛋白N-端的a -氨基或赖氨酸残基的 -氨基。 酶蛋白C-端的羧基、Asp残基B -羧基和Glu残基Y -羧基。 Cys 残基的巯基。 Ser、 Tyr、 Thr 残基的羟基。 Phe 和 Tyr 残基的苯环。 His 残基的咪唑基。 Trp 残基的吲哚基。在实际中偶联最普遍的基团是：氨基、羧基以及苯环。被偶联的基团还应是酶活性的非必需基团，否则将导
