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1、植物组织氨基酸含量的测定(改良的茚三酮比色法)一、实验原理植物吸收的氮主要是氨态氮和硝态氮,后者经过还原过程形成氨,前者经同化后形成谷氨酰胺和谷氨酸,然后形成其他氨基酸和蛋 白质。测定氨态氮的方法有多种,本实验为改良的茚三酮比色法。a-氨基酸与水合茚三酮溶液一起加热,经氧化脱氨变成相应的 a-酮酸,酮酸进一步脱羧变成醛,水合茚三酮则被还原,在弱酸环 境中,还原型茚三酮,氨和另一分子水合茚三酮反应,缩合生成蓝紫 色物质。根据蓝紫色的深浅,在580nm波长下测定吸光值。本实验中 在茚三酮试剂中添加乙二醇并补加正丁醇和丙醇,可以克服茚三酮的 不稳定性。二、仪器设备研钵、烧杯、漏斗、量筒、具塞试管、三
2、角瓶、容量瓶、移液管、天 平、沸水浴锅、可见分光光度计 三、试剂1. 10%醋酸(lOOmL)2. 1%抗坏血酸(100mL)3. 5 u g/mL亮氨酸或丙氨酸溶液(0005g定容至1000mL)4. pH54醋酸缓冲液:& 8mL 0.2mol/L醋酸(冰醋酸1155mL稀释 至1000mL)加412mL 0. 2mol/L醋酸钠(醋酸钠164g或三水醋酸 钠272g配成1000mL)。5. 水合茚三酮试剂:1lg茚三酮放到烧杯中,加入15mL正丙醇,摇匀,溶解,后加入30ml正丁醇和60ml乙二醇,混匀,再加9mL pH5.4醋酸缓冲液,混匀。保存于棕色瓶中,冰箱保存,适用期限10天。四
3、、操作步骤1. 标准曲线的绘制以下表所示量从5 u g/mL亮氨酸或丙氨酸溶液中分别取溶液并 在每个试管中加蒸馏水至2mL,对照仅加2mL蒸馏水,后在各试 管中加入3mL水合茚三酮试剂和O.lmL 1%抗坏血酸,摇匀。盖 上试管塞,于沸水中加热15分钟,取出后搅拌冷却15分钟。冷 却后的有色溶液中加无水乙醇至10mL,在波长580nm处测吸光 值,以氨态氮浓度(ug/mL)为横坐标,吸光值为纵坐标绘制标 准曲线。试管号1234567试剂(mL)00.20.40.81.21.61.8氨态氮浓度(u g/mL)00.5123452. 称取05g新鲜植物材料,放入研钵中,加入5mL 10%醋酸,研磨
4、 后以蒸馏水稀释至100mL,混匀,通过滤纸过滤,弃去最先滤下 的一部分滤液后过滤到100mL三角瓶中。3. 从剩下的滤液中取2mL放入试管中,加3mL水合茚三酮试剂和 0.1mL 1%抗坏血酸,摇匀。盖上试管塞,于沸水中加热15分钟。 同时将盛有对照溶液(提取液用蒸馏水代替)的试管加热。4. 取出后搅拌冷却15分钟。加热形成的红色茚三酮试剂被氧氧化而褪色,茚三酮与氨基酸形成的蓝紫色反应产物仍然存留并变得更加鲜明。冷却后的有色溶液中加无水乙醇至10mL ,混匀。在波长580nm处测光密度值,根据标准曲线查得数值代入以下公式计算氨态氮含量。(10-旅 100 XC)X (100g样品中的氨态氮毫
5、克数)二 X100nC:比色液中氨态氮浓度(ug/mL)n:样品重量(g)100:分析溶液总体积(mL)5.实验结果与分析氨态氮含量标曲:序号1234567氨态氮浓度00.512345OD值0.1520.2370.3180.4150.4840.6070.718D.8D.40045D.GD.5y= 0.1 073k + 0.1S1R2 二 Ci.Ci的餐i方程:y=0.1073X+0.181测定样品液的0D580值为:0.939标曲查得:0. 939二0.1073C-0.181C=10.38 u g/mL(0.1X10X10.38ug/mL)X (100g样品中的氨态氮毫克数)二X100=10.38mg/100g(2X0.5)故:该植物中氨态氮的含量为10.38mg/100g。