谷氨酸发酵生产

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1、谷氨酸发酵生产谷氨酸发酵一、实验目的谷氨酸 （glutamic acid） 是最先成功地利用发酵法进行生产的氨基酸。谷氨酸 发酵是典型的代谢调控发酵，其代谢途径相对研究得比较清楚。因此，了解谷氨酸 发酵机制，掌握其发酵工艺，将有助于对代谢调控发酵的理解，有助于对其他有氧 发酵的理解和掌握，也有助于对已掌握的生化、微生物知识的融会贯通。通过本次实验，掌握有氧发酵的一般工艺，熟练掌握通用机械搅拌罐的设备使 用。二、实验原理1、谷氨酸发酵机制谷氨酸发酵是菌体异常代谢的产物，菌体正常代谢失调时，才能积累谷氨酸。在正常的微生物代谢中，由葡萄糖生成的磷酸烯醇式丙酮酸比天冬氨酸优先合成谷 氨酸。谷氨酸合成过

2、量时，谷氨酸抑制谷氨酸脱氢酶的活力和阻遏柠檬酸合成酶的 合成，使代谢转向天冬氨酸的合成。天冬氨酸合成过量后，反馈抑制磷酸烯醇式丙 酮酸羧化酶的活力，停止草酰乙酸的合成。所以，在正常情况下，谷氨酸并不积 累。谷氨酸生产菌由葡萄糖生物合成谷氨酸的途径见图 5-7 。它包括糖酵解途径（EMP途径）、磷酸己糖途径（HMP途径），三羧酸循环（TCA循环）、乙醛酸循环，伍 德-沃克曼反应（CO的固定反应等）。2冊箭鞭f 隣險*蹤战血穷札诚Is i 人 2丙耕3瞬陨-6:|丙刚初乙rttA址胡痢惟JfeKlfife张MM陆削阳戊二峨L卿；I透过细鹰施斧叙饉图5T谷舷的生物合咸迷轻”帼乙證 车黑限，/乙槪朋舒

3、様酿-/ y、匸杠酸如门5砂畑讦忡擁酸由于谷氨酸生产菌生理方面有以下共同特征，体内的代谢控制平衡被打破， 使谷氨酸得以积累。?谷氨酸生产菌大多为生物素缺陷型。谷氨酸发酵时，糖酵解经过EMP及HMP两个途径进行。生物素充足时，HMP途径所占比例是38% 控制生物素亚适量的结果，发酵产酸期，HMP途径所占比例下降到约为26% EMP途径所占的比例得以提高。通过控制生物素亚适量，更 重要的是由生物素促进的脂肪酸及磷脂合成减少，谷氨酸向膜外漏出， 引起代谢失调，使谷氨酸得以积累。?谷氨酸生产菌的CO固定反应酶系活力强，可通过羧化作用（更多地2 供应固定CO生成苹果酸或草酰乙酸转化成柠檬酸。2? 谷氨酸

4、生产菌的异柠檬酸裂解酶活力欠缺或微弱，使进入谷氨酸生成期后的乙醛酸循环弱，使异柠檬酸更多地转化成a-酮戊二酸。?谷氨酸产生菌应丧失或仅有微弱的a-酮戊二酸脱氢酶活力，使 a -酮戊二酸不能继续氧化。但谷氨酸脱氢酶活力很强，同时NADP氧化能力2弱，这样就使 a -酮戊二酸到琥珀酸的过程受阻，在有过量铵离子存在 时，a -酮戊二酸经氧化还原共轭的氨基化反应生成谷氨酸而分泌泄漏 于菌体外。? 谷氨酸产生菌不利用菌体外的谷氨酸，谷氨酸最终得到积累。2、谷氨酸发酵工艺三、谷氨酸发酵方法( 一 ) 谷氨酸菌种的制备1、斜面种子的制备(1) 斜面培养基配方 : 葡萄糖 0.1,; 蛋白胨 1,; 牛肉膏

5、1,; 氯化钠 0.5,;琼脂 2,;pH 7.0 。接种后于30?恒温培养24 h，备用。2、一级种子的制备(1) 培养基配方 : 葡萄糖 2.5%; 尿素 0.5%; 硫酸镁 0.04%;磷酸氢二钾 0.1%;-6玉米浆2.5%,3.3% (按质增减);硫酸亚铁、硫酸锰各2 X 10 g/L;pH 7.0 。(2) 用 1000 ml 三角瓶装 300 ml 培养基， 封口膜封口， 0.1 MPa灭菌30 min， 接种后 30?、 120 r/min 培养 12 h。(3) 种子质量标准： A560(560 nm吸光度净增值) 0.5;pH 6.4?0.1。 3、二级种子的制备(1) 培

6、养基配方 ： 葡萄糖 2.5%;尿素 0.5%;硫酸镁 0.04%;磷酸氢二钾 0.16%;-6 玉米浆 2.5% ( 按质增减 ); 硫酸亚铁、硫酸锰各 2 X10 g/ L(0.0002,);pH 7.0 。（2）用 1000 ml 三角瓶装 300 ml 培养基， 封口膜封口， 0.1 MPa 灭菌 30 min ， 接种量为 10,（300 ml 培养基 中接入一级菌种 30 ml） ，接种后 30?、 120 r/min 培养 7,8 h 。（3）种子质量标准： A560 0.6;pH 7.2;无杂菌检查阴性（镜检、平板涂布）; 噬菌体检查阴性 （斑点试验法 ）。二级种子培养结束时，

7、无杂菌或 89噬菌体污染，菌体大小均一，呈单个或八字排列。活菌数为 10-10 /ml 。镜检:a、用无菌操作方式取发酵液少许涂布在载玻片上，b、 自然风干后用番红或草酸铵结晶紫染色1, 2 min水洗,c、干燥后在油镜下观察。平板涂布检查 :a、配制营养琼脂培养基,蛋白胨1,牛肉膏0.3,NaCI0.5,琼脂2,pH7.2,灭菌倒平板，b、取少量待检发酵液经稀释后涂布在营养琼脂平板上适宜 条件下培养 ,c、观察菌落形态。噬菌体检查 , 斑点试验法 ,:a、培养基: 葡萄糖 0.1, 蛋白胨 1,牛肉膏 1,NaCI 0.5, 琼脂 2, pH7.0b、采用混菌法制备好混有发酵菌种的平板再用接

8、种环或无 菌吸管取少许发酵液在平板上点种培养后观察是否有 噬菌斑出现。（ 二） 谷氨酸发酵1 、发酵培养基葡萄糖13,;尿素2,;磷酸二氢钾0.1,;硫酸镁0.06,;硫酸亚铁、-6 硫酸锰各 2 X 10 g/(0.0002,)L; 玉米浆 0.6,。2、发酵工艺参数(1)装料系数:0.7(30 L发酵罐装料20 L) 0 培养基灭菌：实消。0.1 MPa灭菌30 min。接种:火焰封口法。接种量:10, 0(5)发酵过程工艺控制表1甸澤过棵工艺控制时间min温度/ CPH搅拌转速mm 101803271 3*20i 80召側327. 2J006001380347.230013B0 2400

9、367. 0200? pH控制：酸碱调节。2 mol/ L NaOH 溶液(称取80 g NaOH溶于100 mL 蒸馏水中)；1 mol/ L HCl 溶液(量取36 mL盐酸溶于64 mL蒸馏水中)。?罐压:0.03,0.05 MPa?消泡：(6)发酵过程分析发酵过程中，按以下频次测定、记录以下指标(按表2-1要求及时记录):pH、风量、还原糖、A、温度1次/小时560谷氨酸含量1次/4 h，发酵12 h起开始(7)质量检测：每4h检查一次，无杂 菌检查，噬菌体检查。(8)放罐:达到放罐标准后，及时放罐。放罐标准：残糖在1,以下且糖耗缓慢(0.15, / h) 或残糖0.5,（ 三 ） 谷

10、氨酸提取1、谷氨酸浓度测定1.1 原理L- 氨基酸与茚三酮共热可发生特有的氨基酸显色反应，产物显示其特有的蓝紫色。不同谷氨酸与茚三酮反应得到的显色产物的最大吸收波长不同，即入max不同;加之显色深浅不同，反应出相应氨基酸的不同含量。以此为依据，可为 L- 谷氨酸 定性及定量。在 pH 5,6 范围内氨基酸的显色反应最灵敏。 1.2 标准样品的制备L-谷氨酸纯品梯度稀释溶液：分别称取0. 05,0. 5 g 分析纯L-谷氨酸，并分 别溶解到 100 mL 蒸馏水中，调节 pH5. 5,6 。1.3 谷氨酸发酵液预处理谷氨酸发酵液离心， 11 400 r/ min ， 5 min ，取上清液弃去菌

11、体，用蒸馏水稀释 100 倍，调节 pH 5.5,6 。1.4 茚三酮试剂的制备称取0.5 g 茚三酮溶于100 mL丙酮中。1.5 pH 调节试剂的制备?2 mol/ L NaOH 溶液：称取 80 g NaOH 溶于100 mL 蒸馏水中; ?1 mol/ L HCl 溶液：量取36 mL盐酸溶于64 mL蒸馏水中。1.6标准溶液OD值的测定569取20只试管，分别加入3 mL配制好的0. 5,5. 0 g/ 100 mL的L-谷氨酸纯品溶液各 2 管。往每只试管中分别沿壁加入 0. 5 mL 的茚三酮试剂，塞上 PVC 胶 塞。摇匀管内溶液，迅速按先后置于 80 ?水浴锅中加热3 min

12、。快速取出保温到时 的试管，将之插入冰浴锅中，静置 3 min。将分光光度计波长调至569 nm处，以 蒸馏水为空白对照，用1 cm石英比色杯比色，测出各浓度标准样品 ODfi。5691.7 发酵样品的谷氨酸含量测定取3 mL预处理好的发酵液加入15 mm 150 mm玻璃试管中，调整pH 5. 5左 右。沿试管壁加入0. 5 mL茚三酮试剂，塞上PVC胶塞。将试管中液体振匀，迅 速置于 80?水浴中加热 3 min 。快速取出保温到时的试管，插入冰浴锅中，静置 3 min。将分光光度计波长调至569 nm处，以100倍稀释的空白液体发酵培 养基为 空白对照，用1 cm石英比色杯比色，测出 0

13、D值。从标准曲线上查出相应 L-569谷氨酸浓度。将从标准曲线上查得的数据乘以稀释倍数即为实际谷氨酸发酵液 中L-谷氨酸浓度值。2、谷氨酸的等电回收2.1 等电回收流程2.1.1测定放罐体积、pH、谷氨酸含量和温度。2.1.2开搅拌，加HCI调节pH至pH3.0,3.2，搅拌育晶20 h，开大冷水降 温，使温度尽可能低。停止搅拌静置沉淀 4h，关闭冷却水，将上层菌体液放至近 谷氨酸层面时，用真空泵将谷氨酸表层菌体和细谷氨酸抽到另一容器里回收。取出 底部谷氨酸，离心甩干，水洗谷氨酸，可改善谷氨酸的质量和色泽。 2.2 操作要 点 八、(1) 将放罐的发酵液先测定放罐体积、pH谷氨酸含量和温度，开

14、搅拌。若放 罐的发酵液温度高，应先将发酵液冷却到 25,30?，消除泡沫后再开始调pHo用盐 酸调到pH5.0(视发酵液中的谷氨酸含量高低而定)，此时以前及时加酸速度稍快， 影响也不大 ;(2) 当pH达到4.5时，应放慢加酸速度，在此期间应注意观察晶核形成的情 况，若观察到有晶核形成，应停止加酸，搅拌育晶 2,4 h 。若发酵不正常，产酸低 于4,，虽调pH到4.0，仍无晶核出现，遇到这种情况，可适当将 pH降至3.5,3.8 左右 ;(3) 搅拌 2 h ，以利于晶核形成，或者适当加一点晶种刺激起晶搅拌育晶2 h后，继续缓慢加酸，耗时4,6 h，调pH至3.0,3.2，停酸复查pH,搅拌2 h后开大冷却水降温，使温度尽可能降低；(5) 到等电点 pH 后，继续搅拌育晶 16 h 以上，停止搅拌静置沉淀 4 h ，关闭冷 却水，吸去上层菌液，至近谷氨酸层面时，用真空泵将谷氨酸表层菌体和细谷氨酸 抽到另一容器里回收。取出底部谷氨酸，离心甩干。发酵液加 HCl育晶 2 h(pH 4,5)加 HCl育晶 2 h(pH 3.8,3.5)加 HCl育晶 2 h(pH3.0,3.2)加HCI(维持pH稳定)搅拌育晶 20 h沉淀 4 h母液 细谷氨酸