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1、Q/KM ZJ 2008液体洗涤剂杀菌试验规程（内部使用）2008年 月曰内部执行质量管理中心实验室引用标准1、 GB15979-2002 一次性使用卫生用品卫生标准2、QB/T2738-2005日化产品抗菌抑菌效果的评价方法3、QB/T2850-2007抗菌抑菌型洗涤剂4、2002 年版消毒技术规范（中华人民共和国卫生部 ）5、 2001 年版 药品微生物学检验手册 （科技出版社）杀菌率试验规程1、试验菌、试验温度、作用时间、试液浓度试验菌种：金黄色葡萄球菌(ATCC 6538 ),大肠杆菌(8099或ATCC 25922 ),白色念珠菌试验温度：20 CC。作用时间： 最短不得小于 30s
2、 。常规作用时间为 2min 、 5min 、 10min 、 20min 。试液浓度： 中和剂鉴定用试液浓度应为正式杀菌试验最高浓度。菌悬液用量：正式 杀菌试验用菌悬液的浓度、取量应与 中和剂鉴定中 1 组、2组所用菌悬液的浓度、 取量相同。2、细菌繁殖体悬液、菌片的制备程序 ：2.1 菌悬液的制备 取冻干菌种管，在无菌操作下，以毛细吸管加入适量营养肉汤，轻柔吸吹数次，使菌种融化分散。取含5.0ml-10.0ml营养肉汤培养基试管，滴入少许菌种悬液，置37C培养18h24h。用接种环取第1代培养的菌悬液，划线于营养琼脂培养基平板上，于37 C培养18h24h。挑取上述第2代培养物中典型菌落，
3、接种于营养琼脂斜面，于37 T培养18h24h，即为第3代培养物（放在4C左右冰箱中保藏。 每隔 2-3 个月移种一次，继续保藏。 ）。 取第 3 代14 代的营养琼脂培养基斜面新鲜培养物（经 18h24h 培养），用 5.0ml 吸管吸取 3.0ml-5.0ml 稀释液加入斜面试管内 ，反复吹吸，洗下菌苔。随后，用 5.0ml 吸管将洗液移至另一无菌 试管中，在手掌上振敲 80次（力度适中，勿溅出），以使细菌悬液均匀。或从新鲜菌种斜面沾取少量菌 苔，接种在适合试验菌生长的培养基中，37 T培养18h24h （或适宜时间）。作为原菌液。（源于药 品微生物学检验手册 211 页） 细菌繁殖体悬液
4、应保存在4C冰箱备用。尽量减少在室温下放置时间，以减少细菌的自然死亡。应当 天使用不得过夜。回收菌数为1 X1049 X104 cfu/ml用PBS液配置 GB15979-2002 一次性使用卫生用品卫生标准回收菌数为1 X 108 5X 108cfu/ml用TSB营养肉汤配置一2002消毒技术规范2.2、菌片的制备程序 ：消毒技术规范 取冻干菌种管，在无菌操作下，以毛细吸管加入适量营养肉汤，轻柔吸吹数次，使菌种融化分散。取含5.0ml-10.0ml营养肉汤培养基试管，滴入少许菌种悬液，置37C培养18h24h。用接种环取第1代培养的菌悬液，划线于营养琼脂培养基平板上，于37 C培养18h24
5、h。挑取上述第2代培养物中典 型菌落，接种于营养琼脂斜面，于 37C培养18h24h，即为第3代培养物。 取第3代14代的营养琼脂培养基斜面新鲜培养物（经 18h24h培养），用5.0ml吸管吸取 3.0ml-5.0ml TSB营养肉汤加入斜面试管内，反复吹吸，洗下菌苔。随后，用5.0ml吸管将洗液移至另一 无菌试管中，在手掌上振敲80次，以使细菌悬液均匀，含菌量1x 1085x 10*cfu/ml。用无菌镊子夹住已灭菌10mm*10mm滤纸一角，一面朝上，注入10ul菌悬液，放到无菌平板内，37 C温箱中干燥20min-30min ,（或在室温自然阴干后使用）制成菌片。每个菌片回收菌落，按活
6、菌培养计数所得结果，应为5x 1055x I06cfu/片。）细菌繁殖体悬液和菌片，用毕应随时保存在4C冰箱内。尽量减少在室温下放置时间，以减少细菌的自然死亡。（应当天使用不得过夜。 ）3、操作程序3.1、悬液定量法杀菌试验操作程序、 样品用无菌标准硬水稀释至同中和剂鉴定用试液浓度，或低于中和剂鉴定用试液浓度，制成（稀释液）试验样液。、 将试管按需要数量分别排列于试管架上，各组由左向右，排序、标记。、配制菌悬液，浓度为1 X1049X104 cfu/ml GB15979-2002一次性使用卫生用品卫生标准或 1X108 5X10 8cfu/ml 2002消毒技术规范、 取杀菌试验用无菌大试管，
7、先加入 0.5ml 试验用菌悬液，再加入 0.5ml 有机干扰物质，混匀，置20 C 5min，用无菌吸管吸取步骤1中的试验样液4.0ml注入其中，立即开启计时器，并迅速混匀（在 手掌上振摇80次）。-见消毒技术规范或吸取试验用菌悬液0.1ml，加入到含5ml样液的试管中，立 即开启计时器，并迅速混匀（在手掌上振摇 80 次）。 -见 QB/T 2738-2005、 作用 2min、 5min、 10min、 20min ，即刻用无菌吸管吸取 0.5ml 移入鉴定合格的 4.5ml 中和剂溶液 中（中和剂的浓度与容量应与鉴定试验结果规定的相同）充分混匀，中和作用 10min 后，取样液、 10
8、 倍系列稀释液0.5ml （见GB15979-2002 ）或分别吸取1.0 ml （-见消毒技术规范）（见图四），置于 2个灭菌平皿，用凉至4045 C营养琼脂培养基或沙氏琼脂培养基（酵母菌）15ml作倾注，转动平皿， 使其充分均匀，琼脂凝固后翻转平板，35 C2 C培养48h （细菌）或（酵母菌）25 C2 C培养72h , 作活菌菌落计数。、 同时用稀释液代替样液进行平行试验，作为阳性对照管。、 阴性对照组：分别吸取试验用相关溶液和培养基进行培养，观察有无污染。、计数菌落时，一般以肉眼观察，必要时用放大镜检查。以菌落数在15cfu300cfu的平板为准，每个稀释度 3个平板生长菌落数全部合
9、乎上述标准， 则以该 3个平板的菌落平均值作为结果； 若有 2个符 合合乎上述标准，则以该合格的 2个平板菌落的平均值作为结果。、试验重复3次，求其平均值。根据各组活菌浓度（cfu/ml），计算杀菌率，见计算公式1。或根据各 组活菌浓度换算为对数值（N），计算杀灭对数值，见计算公式 2。3.2 载体法杀菌试验操作程序、试验样品用无菌标准硬水（过滤除菌）稀释至规定浓度，制成（稀释液）试验样液。、吸取样液5.0ml放入灭菌平皿，另吸取 PBS 5.0ml注入平皿中，作为阳性对照皿。每皿用无菌镊子 夹住菌片一角放入试样皿和阳性对照皿。、作用至设定时间后，即刻用无菌镊子夹住菌片一角，投入含5.0ml中
10、和剂的试管中（中和剂的浓度与容量应与鉴定试验结果规定的相同）充分混匀计时。（见图三 ）、中和10min后，取样液或10倍系列稀释液1.0ml （见图四），置于两个灭菌平皿，接种凉至 4045 C营养琼脂培养基或沙氏琼脂培养基（酵母菌）15ml，转动平皿10-20下，使其充分均匀，凝固 后，于35 C2 C培养48h （细菌）或72h （酵母菌），作活菌菌落计数。、试验重复3次，求其平均值。、阴性对照组：分别吸取试验用相关溶液和培养基进行培养，观察有无污染。A、PBC液（0.03mol/L磷酸盐缓冲液）、B、无菌标准硬水1ml置于灭菌平皿内、C、空白平皿，倾注营养琼脂培养基（细菌）或沙氏琼脂培养
11、基（酵母菌） 15ml培养。、计数菌落时，一般以肉眼观察，必要时用放大镜检查。以菌落数在15cfu300cfu的平板为准，每 个稀释度3个平板生长菌落数全部合乎上述标准， 则以该3个平板的菌落平均值作为结果；若有2个符 合合乎上述标准，则以该合格的2个平板菌落的平均值作为结果。4、计算公式1、杀菌率 X1 =（ A - B ） / A X100%式中：X1 杀菌率（%）；A-对照样品平均菌落数；B-被试样品平均菌落数。2、 杀灭对数值（KL ）=对照组平均活菌浓度的对数值（No）-试验组活菌浓度的对数值（Nx） 备注：计算杀灭对数值时，取小数点后两位值，可以进行数字修约。如果消毒试验组消毒处理
12、后平均生产菌落数，小于等于1时，即大于等于试验前对照组平均活菌浓度的对数值。5、评价标准杀菌率90%，产品有杀菌作用。悬液定量杀灭试验中，各次的杀灭对数值5.0 0,可判定为消毒合格。6操作要点：（消毒技术规范2002版）1、对接触消毒剂（杀菌剂）的样本，在达到规定作用时间，即刻取样移入鉴定合格的中和剂溶液中（中和剂的浓度与容量应与鉴定试验结果规定的相同）；2、即刻混匀，并按规定时间吸取样液进行随后的培养检测；3、在将样本接种培养基以前的操作，应按规定时间内进行，以免微生物与中和剂或中和产物接 触过久。审核：编制:中和剂悬液定量鉴定试验操作程序引用标准：QB/T2738-2005 日化产品抗菌
13、抑菌效果的评价方法（试验菌悬液在1 X 104 9X 104cfu/ml ）44GB 15979-2002 次性使用卫生用品卫生标准（试验菌悬液在1X 10 9 X 10 cfu/ml）2002消毒技术规范（试验菌悬液在1 X 107 5X 107cfu/ml ）一、定义和术语中和剂一在微生物杀灭试验中，试验微生物与杀菌剂作用达到规定时间的终点时，用以中和残留的杀 菌剂，使其不在持续抑制和杀灭微生物的试剂。中和产物一中和剂加杀菌剂（样品）=9: 1,作用10min配置而成。二、中和剂鉴定试验原理中和剂鉴定试验原理试验分组第1组第2组第3组第4组第5组第6组杀菌剂+菌液（杀菌剂+菌中和剂+菌液（
14、杀菌剂+中阳性菌数对照阴性对照。T培养液）+中和剂t培养和剂）+菌液t培养T培养观察杀菌剂对观察残留杀菌观察中和剂是观察中和产阳性对照组。阴性对照组。试验菌有无杀齐U被中和后，否抑菌。物，或未被完火或抑制能力受到杀菌剂作全中和的残留试验目的用后的试验菌杀菌剂对试验是否能恢复生菌的生长繁殖长。是否有影响。三、中和剂鉴定试验中易出现的问题及解决方法出现的问题解决方法1、组无菌生长或组平板上少于 5个菌 落，其它组正常。降低消毒剂浓度或缩短作用时间。2菌落数较多且数量基本相同，其它组正 常。提高消毒剂浓度或延长作用时间。3组中和剂菌落数明显少于 PBS组菌数降低中和剂浓度或改变中和剂成分。4组（中和产物）菌落数明显少于 PBS组菌 数，其它组正常。提高中和剂浓度或改变中和剂成分。5多次更换中和剂均不能得到满意结果。选用载体法进行中和剂鉴定，杀菌试验同时用载体法进行。四、1鉴定试验操作程序中和剂悬液定量鉴定试验操作程序-消毒技术规范试验分
