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1、荧光定量PCR问题疑难解答（一)两天我做原则曲线，线性关系还行，R平方0.998。但是扩增效率只有80%，此外扩增曲线也不是太光滑。2.我用SYBR作为荧光染料，样品的荧光强度也挺低的，只有00-00左右。A:曲线不光滑有时跟染料的量有关，可以加大看看，或者就是扩增产物太少了。. PCR反映效率差：引物，试剂CR条件的因素。做realimec优化体系很重要，你的扩增效率低。可以增长g离子的浓度，如果其她条件都好了,还不行，那就是引物的因素,那你就只能重新设计引物了。2. PR中混入影响反映的物质:模板提取措施需要改善3. 样品稀释不精确：这很重要,做原则曲线诸多不好的时候,诸多都是倍比稀释的问
2、题，正常状况10倍比稀释时，前后是相差3.2个循环。Q：荧光定量CR的敏捷度A：对于染料法的荧光定量来说,t值在130之间比较精确，333之间需要再次确认，在以上范畴内的置信度比较差。Q：原则曲线要反复两三次吗?A：没有人说做定量PCR原则曲线要反复两三次，只是用来做原则曲线的梯度点最佳不要少于4个，否则原则曲线精确性不高。Q：有关荧光定量原则曲线的制作：一般的仪器虽然声称能进行单拷贝检测,但如果不是特别设计的体系,很难做到00拷贝如下的精拟定量，一般用来做原则曲线的最小浓度为100拷贝，再往下可靠性就减少了，这不是稀释或其她什么问题,而是自身你选作原则曲线的浓度以及定量浓度最佳不要低于100
3、0拷贝，如果再低一点,10拷贝也勉强可以接受，否则虽然你做出来，承认度也不会太高。Q：溶解曲线高矮A:T值相似，而峰高下有差别是体现丰度不同,同样的扩增产物也会浮现Tm值有微小差别，一般差别在1度以内都可以接受。融解曲线的纵坐标表达荧光信号对温度的一阶负导数。Q：定量PCR没有扩增A：把定量PCR的产物跑个电泳，看看有无产物，如果电泳有条带，阐明PCR是成功的,只是荧光信号没有读取到，这时要调节染料或探针的浓度（看你是染料法还是探针法);如果电泳没有条带，那么还要在定量仪上优化实验条件。虽然你在一般PR仪上优化过条件,但换了定量PC仪,由于两台仪器的升降温速度及温度精密度等指标存在差别,同样的
4、条件做不出C也是也许的。由于诸多因素的影响，扩增子的溶解温度会有一定变异。溶解温度会受特殊缓冲液的pH值，所用Taq聚合酶，SG和gl2浓度和其她因素的影响。要做溶解曲线的对比你一方面要保证所用的条件相似。：S的稳定性如何? A:只要不进行稀释,G是非常稳定的。一旦稀释,可以保存1周到3个月，这取决于冻融次数，推荐配备成一定浓度的贮存液,用时现用现配稀释液。为优化反映，有必要在所有的常规环节来拟定,优化扩增反映的条件(合适的MC2、NTP和aq酶浓度等）。成果应当在凝胶电泳上有唯一的条带。SG分析的优化重要涉及如下个因素： ) SG浓度 b）引物浓度 c) gCl浓度d) 温度和反映次数推荐的
5、SG终浓度变动范畴是1：500到1：00000。常常用到的浓度范畴是1：00到1：00。引物浓度的优化应当测试不同浓度的正向和反向引物。引物浓度的范畴应当是50M到300nM，然而,也有例外的状况。:荧光定量污染解决措施A:几种月前我也有跟你同样的遭遇,当时跳楼的心均有。后来美国来人给培训,按照她们的规定,污染果真就给控制了，两个月来始终还较好。如下的经验但愿对你有用。 配反映体系和加模板要在不同的屋子进行;2.配体系的屋子准备一件干净的白大衣，每次进去都要记得换白大衣，至少要把别的屋子穿的白大衣脱掉;3. 分装好体系后来把反映板条放在一种有盖的干净的托盘中端到加样的房间;.配体系戴的手套可以
6、带到加样的房间，反过来不可；5. PCR完毕后，反映产物拿到别的屋子扔掉;6. 最重要的就是不要把NA带到配体系的屋子，以上几点也都是为了这一目的。Q：荧光定量eal-timP反复性问题A:建议不要只加1ul，而是稀释10倍左右然后加ul,这样有助于改善反复性。如果你测的是拷贝数,反复性不好是很难避免的。我感觉用YBR gren作alte的误差还是比较大的,它的优势在于敏捷度高，但如果想精拟定量，还是比较困难的,只得反复诸多次，或者多花钱买标记的引物,那个特异性最佳。 ：各位高手，今天第一次做完8个基因的相对荧光定量（dt法），扩增时忘了做融解曲线了,目前是不是没法再做融解曲线了？（AB750
7、0）对于每个基因都作了NC对照，成果显示NTC无扩增,这样能否阐明引物设计得还可以,没有引物二聚体的产生？至于与否有非特异性产物，就必须得做融解曲线了?请帮忙指教一下啊A:把你的定量PCR产物重新作融解曲线，只是新建立一种反映,反映条件按照融解曲线的条件设定就可以了,没必要重新作定量。Ct值2529,融解曲线单峰；nc无CT值，融解曲线无峰，就不用电泳了，可以肯定。模板量增长10倍,C值减小3.32yces。Q：荧光阈值高,怎么改善？A:阈值取决于基线，基线是33cyle左右的荧光信号值原则偏差10倍，也许是背景高，把模板纯化一下看看。要调节一下你的基线的起止循环数。一般开始的循环为2或，中断
8、循环为一次实验最早起峰的Ct-3，即如果一条曲线在第3个循环就已经起峰了,那么基线的中断循环可以设立为13=10。如果你的体系不存在问题，就也许是你的那次实验模板浓度较高,起峰早，导致的阈值线过高。Q:荧光定量PC检测敏捷度和线性范畴的关系A：一般人们觉得的检测敏捷度即检测下限,可以理解为能检测到和精拟定量的最低浓度（拷贝数),而线性范畴为可以检测的区间，即可以检测及辨别的最低浓度到最高浓度的数量级。但两者都与荧光定量PCR仪器及试剂体系有关。Q：reltmePCR T值一般在多少后觉得模板没扩增？A:当进入对数期的循环数不小于35个时,elTie R-R检测无效，基因没有体现；当进入对数的循
9、环数在32-5个循环时,需要有至少3个反复才干判断与否能检测到基因的体现。Q：正常状况NTC是不应当浮现CT值的吗？：如果是探针法，应当没有Ct值,所谓的没有，也是针对不同算法而言的。NTC一般没有明显的指数扩增，因此一般软件不计算Ct。如果是染料法,也许在30个循环后有单薄起峰，并且软件计算出Ct值，这时还要观测溶解曲线,看扩增产物与否是引物二聚体。大多状况是二聚体,这时也可以优化条件,例如提高退火温度等。如果是探针法,阴性对照起峰肯定是污染，如果是染料法,还要看溶解曲线:如果溶解曲线的T值在80度如下,那么很也许是引物二聚体；如果溶解曲线是双峰或更多峰，其中有与加模板后的扩增产物的m值相似
10、的峰,那么就意味着存在污染。Q:real tie PCR无成果,而用产物跑电泳条带很清晰,什么问题？A：我也浮现过此状况,后来发现是由于加样的时间太长了,荧光染料暴露时间太长了，荧光基团淬灭了,浮现上述问题尚有一种状况，那就是荧光PCR仪的荧光采用信号值太低,有时也不稳定。如果你使用探针法,有荧光信号而没有求出Ct值,那么也许你的探针浓度有问题,也许太高或者太低了，也许变化探针浓度看看。Q：最佳荧光采集温度A:采集荧光的时机不是决定于温度,而是决定于采用的措施。如果采用染料法,一般要在延伸阶段的末点进行检测，而2度延伸的效率最高，因此采用染料法时大多在72度检测。如果扩增产物中存在引物二聚体，
11、也有采用更高的读板温度,例如76度、8度等，这时的读板温度与引物二聚体的m值有关。如果采用TaqMa探针法，由于Taa探针是累积荧光,理论上说在任何环节检测都可以，但目前TaqMa大多采用两步法，因此在退火的末点进行检测即可。如果采用分子信标的措施,就要在退火的末点进行检测。如果采用FRET探针法，要在退火时进行荧光检测。：原则曲线的讨论A:有一点可以告诉你:样品浓度太高，beta-actin都是很高的,要美丽就稀释0倍后再做。浓度高,很容易导致污染。并且第一二个梯度没有分开啊。原则曲线的落点局限在1个循环此前,那样你得到的反映有效线性范畴太窄,就是说要很高浓度的样品才合用你这原则曲线。：定量
12、PCR中,质粒作为原则分子为什么要线性化:由于你要检测的目的基因如果不出意外的话,应当是线性的吧，而你用来定原则曲线的目的基因确是连接在环状的质粒上的。我想单从变性和复性的难易上就会有很大的区别，固然会对引物的结合等各方面导致影响,何况环状的空间构象和线性的空间构象上的差别了。做原则曲线时的基本原则之一就是要尽量的模仿需要定量的基因所在的自然条件,因此说，如果做原则曲线时你可以有条件做到用和你要检测的基因同样的原则品做原则曲线的话,就不要选择把一段基因克隆到质粒上。但是一般状况下是很难做到的。楼上说的没有酶切效果还行,那只是还行。荧光定量本来就是很容易受到诸多因素影响的实验,固然是规定严点好了
13、,固然如果你检测的基因自身就是环状的，那固然不用线性化了，那样反而不好了!线性化比较麻烦:一方面要酶切，保证完全酶切,才干所有线性化。然后要回收,质粒酶切后再回收容易被破坏，并且回收率也不是很高。第三，线性化的质粒不容易保存，相对于环状质粒来说。因此,如果有实验证据证明不线性化的质粒可以用,那就可以省去诸多事情了。Fig. 6 soshows te efficiec of te P reation isnotalted by using cicular plid D n plae f larsed plsid DNA.线形化与环状质粒比较文章评论:这篇文章用这个质粒对线性化和非线性化做了比较,
14、从实验成果看线性化并没有对原则曲线产生任何变化。但是这篇文章只是摆出了实验成果,并没有从原理上分析这个实验成果的因素，因此线性化对于原则曲线的作用并不能以这篇文章的成果来外推。就是说也许需要更多的实验成果,或者从原理上分析了这篇文章的成果，才干得出结论来阐明，线性化的确对于所有,或大部分的质粒原则分子是不必要的。荧光定量PCR问题疑难解答(二）Q:realtm pcr不同基因之间的阈值（thrshold）是不是要同样啊?A：如果做原则曲线或者相对定量,建议阈值还是同样比较好。并且阈值一般要放置于扩增曲线的指数段，即荧光数据对数坐标轴下的线性段。如果扩增曲线的效率接近,阈值线的位置对于定量成果的
15、影响是微乎其微的。：扩增曲线本底不断升高是什么因素?A:我近期也遇到过这种现象，目前基本解决了,因素也许如下：1、试剂质量差是重要因素,我用ABI的SYR试剂做了一年历来没有遇到过类似问题,而近期换成东洋纺的试剂就浮现了这个问题,因此最佳不要贪便宜用小鬼子的试剂!2、模板不纯是一种重要因素,我用东洋纺的试剂浮现问题后,用ddH2O稀释10倍以上(一定不要用E稀释，要否则也许会更差）,问题基本解决；3、如果模板稀释后基线尚有一定的上升，成果分析时可以将基线从6以上设,避开初始的几种上升厉害的循环;建议:要主线解决此问题请用质量可靠的试剂,便宜没好货!Q:分子信标做的阴性对照,曲线为一条斜线,什么因素?A:和我此前做得没消除背景的曲线挺相像。很也许是试剂的问题,我用东洋纺的试剂也得到过类似的曲线，换了试剂就好了!探针设计的问题！尚有反映液体试剂酶离子调节。:原则曲线检测限A：这是由于ABI仪器采用半导体加热，其边沿效应致使6孔加热模块的中央温度高,周边温度低。由于定量原理是通
