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1、SDSPAGE测定蛋白质相对分子质量一、前言聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳，简称PAGE，是以聚丙烯酰胺凝胶作为支 持介质的一种常用电泳技术。聚丙烯酰胺凝胶由单体丙烯酰胺和甲叉 双丙烯酰胺聚合而成，聚合过程由自由基催化完成。催化聚合的常用 方法有两种:化学聚合法和光聚合法。化学聚合以过硫酸铵(APS)为催 化剂，以四甲基乙二胺(TEMED)为加速剂。在聚合过程中，TEMED催 化过硫酸铵产生自由基，后者引发丙烯酰胺单体聚合，同时甲叉双丙 烯酰胺与丙烯酰胺链间产生甲叉键交联，从而形成三维网状结构。PAGE根据其有无浓缩效应，分为连续系统和不连续系统两大类， 连续系统电泳体系中缓冲液pH值及
2、凝胶浓度相同，带电颗粒在电场 作用下，主要靠电荷和分子筛效应。不连续系统中由于缓冲液离子成 分，pH，凝胶浓度及电位梯度的不连续性，带电颗粒在电场中泳动不 仅有电荷效应，分子筛效应，还具有浓缩效应，因而其分离条带清晰 度及分辨率均较前者佳。不连续体系由电极缓冲液、浓缩胶及分离胶 所组成。浓缩胶是由AP催化聚合而成的大孔胶，凝胶缓冲液为pH6.7 的Tris-HCl。分离胶是由AP催化聚合而成的小孔胶，凝胶缓冲液为 pH8.9 Tris-HCl。电极缓冲液是pH8.3 Tris-甘氨酸缓冲液。2种孔 径的凝胶、2种缓冲体系、3种pH值使不连续体系形成了凝胶孔径、 pH值、缓冲液离子成分的不连续性
3、，这是样品浓缩的主要因素。SDS是阴离子去污剂，作为变性剂和助溶试剂，它能断裂分子和 分子间的氢键，使分子去折叠，破坏蛋白分子的二、三级结构。而强 还原剂如巯基乙醇，二硫糖醇能使半胱氨酸残基间的二硫键断裂。在 样品和凝胶中加入还原剂和SDS后，分子被解聚成多肽链，解聚后的 氨基酸侧链和SDS结合成蛋白-SDS胶束，所带的负电荷大大超过了 蛋白原有的电荷量，这样就消除了不同分子间的电荷差异和结构差 异。SDS-PAGE 般采用的是不连续缓冲系统，与连续缓冲系统相比， 能够有较高的分辨率。浓缩胶的作用是有堆积作用，凝胶浓度较小，孔径较大，把较稀 的样品加在浓缩胶上，经过大孔径凝胶的迁移作用而被浓缩
4、至一个狭 窄的区带。当样品液和浓缩胶选TRIS/HCl缓冲液，电极液选TRIS/ 甘氨酸。电泳开始后，HCl解离成氯离子，甘氨酸解离出少量的甘氨 酸根离子。蛋白质带负电荷，因此一起向正极移动，其中氯离子最快， 甘氨酸根离子最慢，蛋白居中。电泳开始时氯离子泳动率最大，超过 蛋白，因此在后面形成低电导区，而电场强度与低电导区成反比，因 而产生较高的电场强度，使蛋白和甘氨酸根离子迅速移动，形成一稳 定的界面，使蛋白聚集在移动界面附近，浓缩成一中间层。此鉴定方法中，蛋白质的迁移率主要取决于它的相对分子质量， 而与所带电荷和分子形状无关。聚丙烯酰胺凝胶电泳作用原理聚丙烯酰胺凝胶为网状结构，具有分子筛效应
5、。它有两种形式: 非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(Native-PAGE)及SDS-聚丙烯酰胺凝胶 (SDS-PAGE)；非变性聚丙烯酰胺凝胶，在电泳的过程中，蛋白质能够 保持完整状态，并依据蛋白质的分子量大小、蛋白质的形状及其所附 带的电荷量而逐渐呈梯度分开。而 SDS-PAGE 仅根据蛋白质亚基分子量的不同就可以分开蛋白 质。该技术最初由 shapiro 于 1967 年建立，他们发现在样品介质和 丙烯酰胺凝胶中加入离子去污剂和强还原剂(SDS即十二烷基硫酸钠) 后，蛋白质亚基的电泳迁移率主要取决于亚基分子量的大小(可以忽 略电荷因素)。二、实验目的1. 学习SDS-PAGE测定蛋白质分子量的原
6、理。2. 掌握垂直板电泳的操作方法。3. 运用SDS-PAGE测定蛋白质分子量及染色鉴定。三、实验原理1. 电泳 带电颗粒在电场作用下，向着与其电荷相反的电极移动的现象。在一定的电场强度下，分子在凝胶介质中的迁移速率取决于分子的大 小、构型和带电量的大小。2. PAGE聚丙烯酰胺凝胶(PAG)是由单体丙烯酰胺(Acr)和交联剂甲叉双 丙烯酰胺(Bis)在加速剂四甲基乙二胺(TEMED)和引发剂过硫酸铵(AP) 的作用下聚合交联而成的三维网状结构的凝胶。以此凝胶作为支持介 质的电泳称为PAGE。PAGE具有电泳和分子筛的双重作用。PAG机械强度好，有弹性，透明，化学性质稳定，改变Acr浓度 或A
7、cr与Bis的比例可以得到不同孔径的凝胶。PAGE 分为连续系统和不连续系统两大类。连续系统电泳体系中 缓冲液pH值与凝胶中的相同.带电颗粒在电场作用下，主要靠电荷和 分子筛效应。不连续系统中带电颗粒在电场中泳动不仅有电荷效应、 分子筛效应，还具有浓缩效应，因而其分离条带清晰度及分辨率均较 前者佳。3. SDS-PAGE基本原理SDS-PAGE是在蛋白质样品中加入SDS和含有巯基乙醇的样品处 理液，SDS是一种很强的阴离子表面活性剂，它可以断开分子和分子 间的氢键，破坏蛋白质分子的二级和三级结构。强还原剂巯基乙醇可以断开二硫键破坏蛋白质的四级结构。使蛋 白质分子被解聚成肽链形成单链分子。解聚后
8、的侧链与SDS充分结合 形成带负电荷的蛋白质-SDS复合物。蛋白质分子结合SDS阴离子后，所带负电荷的量远远超过了它原 有的净电荷，从而消除了不同种蛋白质之间所带净电荷的差异。蛋白 质的电泳迁移率主要决定于亚基的相对分子质量。而与其所带电荷的 性质无关。当蛋白质的分子量在17,000165,000之间时，蛋白质-SDS复 合物的电泳迁移率与蛋白质分子量的对数呈线性关系：lgMW = K - bm将已知分子量的标准蛋白质在SDS-PAGE中的电泳迁移率对分子 量的对数作图，即可得到一条标准曲线。只要测得未知分子量的蛋白 质在相同条件下的电泳迁移率，就能根据标准曲线求得其分子量。四、实验器材和材料
9、试剂仪器:垂直板型电泳槽;直流稳压电源;50或100 口 l微量注射器、玻璃板、水浴锅，染色槽;烧杯;吸量管;常头滴管等。原料:低分子量标准蛋白质按照每种蛋白0.5 - 1 mgm l - 1样品溶解 液配制。可配制成单一蛋白质标准液，也可配成混合蛋白质标准液。试剂：分离胶缓冲液(Tris-HCl缓冲液PH8.9)：取1mol/L盐酸48mL, Tris 36.3g，用无离子水溶解后定容至100mL；(2) 浓缩胶缓冲液(Tris-HCl缓冲液PH6.7)：取1mol/L盐酸48mL,Tris 5.98g，用无离子水溶解后定容至100mL；(3) 30%分离胶贮液:配制方法与连续体系相同,称丙
10、烯酰胺(Acr) 30g及N, N-甲叉双丙烯酰胺(Bis)0.8g,溶于重蒸水中，最 后定容至100ml,过滤后置棕色试剂瓶中，4保存；(4) 10%浓缩胶贮液:称Acr 10g及Bis 0.5g，溶于重蒸水中，最后定容至100mL,过滤后置棕色试剂瓶中，4贮存；(5) 10%SDS溶液:SDS在低温易析出结晶，用前微热，使其 完全溶解；(6) 1%TEMED;(7) 10%过硫酸铵(AP)：现用现配；(8) 电泳缓冲液(Tris-甘氨酸缓冲液PH8.3)：称取Tris6.0g,甘氨酸28.8g, SDS 1.0g,用无离子水溶解后定容至IL；(9) 样品溶解液:取SDS100mg,巯基乙醇
11、0.ImL,甘油ImL, 溴酚蓝2mg，0.2mol/L, pH7.2磷酸缓冲液0.5mL,加重蒸水至10mL(遇 液体样品浓度增加一倍配制)。用来溶解标准蛋白质及待测固体；(10) 染色液:0.25g考马斯亮蓝G-250，加入454mL 50%甲 醇溶液和46mL冰乙酸即可；(11) 脱色液:75mL冰乙酸，875mL重蒸水与50mL甲醇混匀。五、实验操作1. 制胶玻板的清洗 用海绵和洗涤剂轻柔地清洗,严禁使用刷子和颗粒状的去污粉与 洗衣粉,完全冲洗干净后烘干。2. 垂直板电泳槽:I页脚(C-bBiirR fl-end)0冲矗ft弓遥期6愎 tShart pla站、电邀悔CoiIih)(Co
12、alf上枠弓I导臭逐 CSupIg .jiil3. 凝胶的制备分离胶的制备配制12%分离胶。在烧杯中依次加入重蒸水3.35ml,分离胶缓冲 液(1.5mol/L Tris-HCl,pH8.8) 2.5ml,10%SDS 0.1ml,凝胶储备液 4.0ml, 10%过硫酸铵50ul和TEMED 10ul。由于AP和TEMED相遇后 凝胶即开始聚合，所以应立即混匀混合液，用移液枪抽取凝胶液加至 长、短玻璃板间的窄缝，留出梳齿的齿髙加1cm的空间停止灌胶，小 心覆盖一层蒸馏水，371烘箱下聚合(约30 min)。待分离胶聚合 完全后，除去覆盖的蒸馏水。浓缩胶的制备配制5%浓缩胶。在烧杯中依次加入重蒸
13、水2.92ml,浓缩胶缓冲液 (0.5mol/L Tris-HCl,pH6.8) 1.25ml,10% SDS 0.05ml,凝胶储备液 0.8ml, 10%过硫酸铵25ul和TEMED 10ul。由于AP和TEMED相遇后 凝胶即开始聚合，所以应立即混匀混合液，用移液枪抽取凝胶液加至 长、短玻璃板间的窄缝，灌满后小心插入梳齿，避免混入气泡，371 烘箱下聚合(约30 min)。4. 蛋白质样品的处理标准蛋白质样品的处理低分子量标准蛋白试剂盒:兔磷酸化酶BMW=97,400牛血清白蛋白 MW=66,200 牛碳酸酐酶MW=31,000胰蛋白酶抑制剂 MW=20,100鸡蛋清溶菌酶 MW=14,
14、400后，沸水浴中加热3-5min后上样。样液的准备用移液枪小心吸取处理好的血清50ul至1.5ml的离心管中，再加入50ul上样缓冲液，混匀后沸水浴中加热3min，取出冷却后加样。5. 加样用移液器分别取5 ml样品液，小心将样品加到凝胶凹形样品槽 底部。6. 电泳 将电泳仪的正负极与电泳槽正负极相连接，打开电泳仪开关，设置电压为200V，电泳60mins，此时溴酚蓝染料达到凝胶底部，停止电 泳，关闭电源。7. 染色与脱色 电泳结束后，取下玻板，在自来水下用特制板撬开短玻璃板，从凝胶板上切下一角作为加样标记，在两侧溴酚蓝染料区带中心，插入 细铜丝作为前沿标记。加入染色液染色60 mins，再
15、用脱色液脱色， 直至蛋白质区带清晰，即可计算相对迁移率。8. 结果处理量出加样端距细铜丝间的距离（cm）以及各蛋白质样品区带中心 与加样端的距离（cm），按下式计算相对迁移率mR：_ 蛋白质样品迁移距离（C7H）=漠酚蓝区带距加样端距离（cm）六、实验结果及数据处理1. 实验现象：脱色结束后，经观察可知，点有 maker 的孔跑出来的有 5 个清晰 笔直的条带，迁移率由低到高排列这5 个条带分别是分别是兔磷酸化 酶B、牛血清白蛋白、牛碳酸酐酶、胰蛋白酶抑制剂、鸡蛋清溶菌酶。点有血清蛋白的点样孔跑出的结果在分离胶与浓缩胶交界处出 现一大团成分未知着色团，经老师讲解并且上网查阅资料得知这种现 象可能是所谓的“鬼带”现象。“鬼带”就是在跑大分子构象复杂的 蛋白质分子时，常会出现在泳道顶端（有时在浓缩胶中）的一些大分子 未知条带或加样孔底部有沉淀。出现这种现象主要由于还原剂在加热 的过程中被氧化而失去活性，致使原来被解离的蛋白质分子重新折叠 结合和亚基重新缔合，聚合成大分子，其分子量要比目标条带大，有 时不能进入分离胶。但它却于目标条带有相同的免疫学活性，在 WB 反应中可见其能与目标条带对应的抗体作用。处理办法为：在加热煮 沸后，再添加适量的 DTT 或 Beta 巯基乙醇，以补充不足的还原剂; 或可加适量EDTA来阻止还原剂的氧化。除此之外还观察到存在“拖尾现象”。这主要是样品
