《微波_氯化锂复合诱变筛选耐受高浓度丁醇菌株》由会员分享，可在线阅读，更多相关《微波_氯化锂复合诱变筛选耐受高浓度丁醇菌株（12页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、微波-氯化锂复合诱变筛选耐受高浓度丁醇菌株摘 要：菌株耐受丁醇能力不高是制约提高传统丁醇发酵产量的重要因素之一，选择并构建新 的丁醇生产异源重组菌株并提高其耐受高浓度丁醇的能力是提高丁醇能力的有效途径。试验 以丁醇耐受性为 2.5%的发酵乳杆菌为出发菌株，对其进行微波-氯化锂复合诱变处理，然后 经过初筛和复筛，得到丁醇耐受性提高的菌株。结果表明：当微波功率为800 W,频率为2 450 MHz,微波处理时间为55 s,氯化锂浓度为1.2%时，致死率达85.96%,突变菌株丁醇耐受 性提高到 3%，并且遗传稳定性实验证明其丁醇耐受性遗传稳定。关键词：发酵乳杆菌；丁醇耐受性；微波-氯化锂复合诱变S
2、creening of High Concentration Butanol Tolerance Strainsby Microwave-LiCl Complex MutationAbstract： One of the important factors to restrict traditional production of butanol fermentation was the low ability of strains tolerancebutanol.It could effectively improve the butanol capacity by selecting a
3、nd constructing new heterologous recombinant strains ofbutanol production and improving its ability to tolerate high concentrations butanol.In this experiment,the Lactobacillus fermentumwith butanol tolerance of 2. 5% as the original strain was conducted through microwave- LiCl complex mutation,scre
4、ened and rescreened,then the strains with high ability of tolerance butanol were obtained. The results showed that under the condition of 800 W microwavepower,2450MHzfrequency,55smicrowavetreatment,1.2%concentration of LiCl and 85.96% death rate,the abilitybutanol tolerance of mutant strains was inc
5、reased to 3%, and their heredity stability was proved by genetic stability experiments.Key words：Lactobacillus Fermentum ； butanol tolerance ； microwave-LiCl complex mutation近几年,利用生物发酵技术以玉米及其副产物 含有的丰富纤维为原料生产正丁醇得到了广泛的关 注,这既可以变废为宝提高玉米的利用率和经济附 加值,同时也能缓解国际能源安全和环境恶化的双 重压力1。然而在发酵产物丁醇浓度达到或超过11 gL-1时,将明显抑制发
6、酵菌株的生长,甚至导致 细胞死亡,这一问题制约了该产业的发展2。目前梭菌的丁醇合成及代谢网络已比较清晰3，并且也成功利用其构建菌株表达系统合成出丁醇4-6。但由于 菌株本身对丁醇的耐受性不高使丁醇产量没有明显 提高，因此寻找耐受高浓度丁醇微生物对丁醇异源 重组生产至关重要，已报道的大多数菌株丁醇耐受 性在1%2%之间7，目前丁醇耐受性较高的是Lactobacillus plantarum E4,其耐受性可达 3%8。能够 耐受高浓度丁醇的菌株大多是乳酸菌,说明乳酸菌 具有天然的丁醇耐受性。在初筛得到的菌种丁醇耐 受能力不高情况下,需要经过诱变提高其耐受能力 才具有实用价值。微波辐照可引起微生物
7、分子强烈 的电极性振荡,使 DNA 分子结构发生变化导致可遗 传的变异9,从而获得稳定的突变体10-11。氯化锂可加 强射线对细胞的破坏性,对基因修复系统中的一些 酶产生了阻遏作用12。实验室筛选出一株丁醇耐受性 较高的发酵乳杆菌,其耐受性为 2.5%,为了进一步提 高其耐受性,利用微波诱变和氯化锂复合诱变处理, 以期获得耐受能力有明显提高的突变株。并以文献中报道的丁醇耐受性为3%的短乳杆菌(Lactobacillus brevis )作为参照菌株。1 材料与方法1.1 材料与试剂1.1.1 菌株出发菌种：发酵乳杆菌(Lactobacillusfermentum),实验室筛选保藏，经鉴定丁醇耐
8、受性为 2.5%。标准菌株：短乳杆菌 (Lactobacillus brevis)ATCC367 购于中国工业微生物菌种保藏中心，用作试验对照菌株。 1.1.2培养基与试剂MRS液体培养基（gL-1）：蛋白胨10.0 g,酵母膏4.0 g,牛肉膏5.0 g,葡萄糖20.0 g,乙酸钠5.0 g,吐温80 1.0 mL,磷酸氢二钾2.0 g,柠檬酸二铵2.0 g,MnSO4H2O 0.05 g,MgSO47H2O 0.2 g, pH 6.2,121 C 灭菌 15 min。MRS固体培养基（gL-1）：液体培养基中加入15 g 琼脂，pH 6.26.4,121 C灭菌 15 min。 正丁醇为国
9、产分析纯购于天津市大茂化学试剂 厂；氯化锂为国产分析纯购于天津市大茂化学试剂 厂。1.2 仪器与设备Thermo酶标仪上海赛默飞世尔仪器有限公司； MM721AAU-PW微波炉广东美的微波炉制造有限 公司； BCN- 1 36 0超级洁净工作台哈尔滨市东联电 子技术有限公司；TGL-16B离心机上海安亭科学仪 器制造厂。1.3 诱变方法1.3.1菌悬液的制备 将出发菌株活化后的菌液转接到 MRS 液体培 养基上，37 C静置培养至对数生长期中后期，然后取 出菌液10 mL，在3 000 rmin-1下离心15 min，弃掉 上清液,将沉淀收集起来,用无菌生理盐水多次洗 涤。最后将细胞浓度调节为
10、 106cfumL-1,制成细胞悬浮液。1.3.2微波诱变取10 mL菌体悬浮液置于0 90的无菌平皿中，开启微波炉预热10 min，使微波稳定。将平皿置于微波炉内，分别照射5、15、25、35、45、55和65 s。每隔10 s取出冰浴，以减少热效应引起的菌体死亡14。诱变后放入冰箱暗处理5 h后，取100 m L菌悬液分别 均匀涂布于MRS固体培养基上，37 C静置培养，并 以没有经过微波处理的菌液做对照。1.3.3氯化锂诱变取200 m L细胞浓度调节为106cfumL-1的菌悬液，涂布于氯化锂浓度梯度分别为 0%，0.4%，0.8%，1.2%, 1.6%, 2.0%的MRS平板上，每个
11、浓度梯度对应 的做3组平行。在37 C静置培养3 d,计算致死率。 根据致死率曲线，确定最佳诱变剂量。1. 3. 4微波-氯化锂复合诱变首先采用微波辐照的适宜诱变时间进行诱变， 然后诱变后的菌液采用氯化锂诱变适宜浓度进行复 合诱变。1.4 致死率的计算任何诱变剂都同时有具有致死和诱变的双重效应，因此需要测定出发菌株经诱变处理后的致死率曲线，确定最佳的诱变条件15。待诱变处理的菌液长 出菌落后进行计数，取三个平皿的平均值，以未经诱 变的菌液作对照，按照如下公式计算致死率。致死率/%=A1-A2A1X100式中：A1为未被处理菌体长出的菌落数；A2为处 理后菌体长出的菌落数。1.5 高耐受丁醇菌株
12、的筛选1.5.1初筛挑选直径约3 mm、形状规则的诱变后单菌落移至MRS固体斜面培养基上，待生长成熟后接入摇瓶 进行培养。再分别接种于含有 2.5%浓度正丁醇的液体 培养基中，继续培养16 h后，取200 p L菌液加入96 孔板中用酶标仪测得 OD600 nm，计算其相对生长率16，得到相对生长率大于 30%的菌株进行复筛。相对生 长率计算公式如下：相对生长率=(d-b-c) (/a-b-c)X100%60第 5期式中：a为测定的菌株在不含丁醇的培养基中生长的吸光值；b 为测得的空白培养基的吸光值；c为计算得接种时的吸光值(2%接种量X活化后 的菌液的吸光值)；d 为测定的菌株在加入一定浓度
13、丁醇的培养基 中生长的吸光值。1.5.2复筛将初筛得到的菌株 2%接种量转接含有浓度为3%和 3.5% (v v-1)丁醇的液体培养基中，37C培养16 h,取200 p L菌液加入96孔板中用酶标仪测得OD600，计算其相对生长率，同时以标准菌株作为对 照，所有试验重复 3次。1.6 诱变菌株的遗传稳定性试验诱变菌株的遗传稳定性是非常重要的17，通常情况下，诱变后得到的具有优良性状菌株的性状不是 很稳定，可能会在多次传代的过程中出现退化的现 象，因此诱变后对突变菌株的高耐受丁醇性能进行 遗传稳定性试验是非常必要的。为考察突变株耐受 丁醇能力的稳定性，将获得的突变菌株在MRS斜面 培养基上连续
14、传代 10次，每一代均接入含有3% (vv-1)丁醇浓度的MRS液体培养基中37 C，培养24 h后测定其0D600，计算相对生长率。每代重复3 次，观察其遗传稳定性。2 结果与分析2.1 微波诱变致死率的计算结果由图 1可知，随着微波辐照时间的增加，菌株的致死率也在随之增加。当辐照时间为55 s时致死率在 80%90%之间，之后随着时间的延长逐渐接近100%。说明菌株对 55 s 的微波处理时间较敏感，诱变效果明 显。因此初步选择微波辐照的适宜时间为 55 s。2.2 氯化锂诱变致死率的计算结果在培养基中分别加入终浓度为 0%，0.4%，0.8%，1.2%，1.6%，2.0%的氯化锂浓度梯度
15、，涂布菌液培养 后计数并计算死率。由图 2可知，随着氯化锂浓度的 增加，菌落数急剧减少，菌株的致死率在不断升高。 结果表明当氯化锂浓度为 1.2%时，菌株的致死率在 80%90%之间，在浓度为 1.6%时逐渐接近 100%，浓 度为 2.0%时达到 100%。在根据致死率在 80%90% 时，发生正向突变的概率最高，因此初步确定氯化锂 适宜处理质量分数为 1.2%。2.3 复合诱变处理致死率的计算结果将菌株在微波辐照时间为55 s,氯化锂浓度为1.2%的条件下进行复合诱变，同时进行 5组平行试 验。以未经任何处理的菌株作为对照，发现菌落数明 显减少，经计算致死率平均达到 85%。较微波诱变和 氯化锂单一诱变的致死率稍高一点。2.4 微波诱变突变菌株筛选结果从微波处理时间为55 s的菌株中挑取50个单 菌落进行筛选，得到 11株在含有丁醇浓度为 2.5% (vv-1) 的液体培养基中的相对生长率大于30%，在丁醇浓度为3% (vv-1)
