CFX 荧光定量PCR仪操作指南

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1、C F X96实时荧光定量PCR仪操作流程及注意事项开始运行仪器打开电脑打开定量PCR仪底座开关启动CFX Ma n ager软件放置样品将PCR反应体系加入到0.2m 1低缘八联管，盖上管盖;或加入低缘96孔板，用光学级封膜封好、注意， 必须带一次性塑料手套，不要让手指接触到反应管表面。将反应管按顺序放入仪器得加热孔中。设置程序，运行实验定量PCR软件操作基本步骤为：a、设置热循环程序文件（Protocol Tab） b。设置反应板 文件（Plate Tab）。 C。点击“ Start Run ”键，运行程序热循环程序文件（Protocol Tab）设置指 南：点击Edi t （编辑）或Cr

2、eat e New（创建新程序）。反应板设置文件（Plat e Tab）设置指南:选择本次实验所要使用得荧光染料种类;单击样品类型;如 要某些反应孔第一荧光染料对应得样品类型为标准品（Standard），点击“Dilution Series ”键可 设置其标准品浓度及稀释倍数。点击“ Start Run ”键、单击。pen lid（打开热盖）或Close 1 id（关闭热盖）放置样品；单击 Sta r t Run，保存文件，开始运行程序。结果分析PCR反应结束后,软件会自动计算标准曲线与Ct值等、如需进行表达量分析、等位基因分析等，在软件窗口选择相应分析功能。点击右上方得“Report键,还可

3、输出结果报告单关闭运行仪器实验结束后取出反应管，顺序关闭CFX Man a ger软件、定量PCR仪电源，关闭电脑。注意!CFX仪器 上盖部分为全自动控制，在通电状态，严禁任何人为干涉上盖开启或关闭得行为,此类行为会导致上盖故障， 危及仪器使用。CFX Man a ger软件操作快速指南实验操作程序设置图1显示实验设置窗口中一个预览得程序。点击Create New,打开程序编辑器创建一个新得程序、点击Select Exis t ing，通过浏览器加 载一个程序或对其进行编辑。使用Express Load 下拉菜单直接加载一个程序或对其进行编辑。点击E dit Selec ted,打开程序编辑器

4、编辑所选程序得各个步骤、点击Start Run开始运行当前加载得 程序。程序编辑器程序编辑器可用来创建一个新程序或编辑一个巳存在得程序，图2。1. 在图形或文本模式下选择任何需要编辑得一步（该步骤会用蓝色高亮显示），点击温度或保持时间 进行直接编辑、2、点击Insert Step在程序中增加一个温度步骤。点击Delete Step在程序中删除选中得 步骤、3。点击 Add Plate Read t o S tep，在程序中指定获取荧光数据得时间。如果当前得高亮显示步骤巳经进行了读板设置，则这一选项变为Remove Plate Read。如果在这一步不想获取数据，则点击 Remove Pl a

5、te Read。4. 点击GOTO步骤得重复次数，改变程序中得循环次数，图2第4步、点击GOT 0步骤数可改变GOTO 循环中所包含得步骤。增加一个梯度步骤：1、在程序编辑控制窗口中，点击Insert Gradient,图2。2。对梯度中最低与最高温度值进行编辑，在图形模式，文本模式下或出现在文本模式右侧得梯度范围 计算器中直接点击数值进行编辑，图3。3。在梯度范围计算器中，对任何一行都可以赋予一个指定得温度。每行得温度都会调整为合适得温 度来满足指定得温度范围、增加熔解曲线：1.在程序编辑控制窗口中，点击Inse rt Melt Curve，图2。2。在图形或文本显示模式下，点击温度值来编辑

6、融解曲线范围得最低与最高温度，图4第5步、使。C0.06闯1 95.0 C 旧3 &0广 2 95。 C for0:103 550 C for 0:30+Read-E GOTO 2 . 3$ g*S ifeM Cmveto 95.0jhaerrieffit Q 5 _far+ A a：e RtadENDSi3. 点击增量值来编辑数据获取得温度区间。4、点击保持时间编辑每一个增量温度得保持时间。CFX Man ager软件数据分析快速指南定量分析数据浏览扩增图表可以显示实验中每个循环每个孔收集得相对荧光信号曲线。点击位于扩增图表下方得荧光 检查窗，选择需要显示得荧光数据，图1。在孔选择器中点击孔

7、，行或列来显示所选孔得荧光数据，图1、选 中得孔就是蓝色得，未选中得孔就是亮灰色得、若把光标置于荧光信号曲线上，孔选择器中得孔上，数据电子 表格得孔上，或者标准曲线上均可以显示出相应得信息。酬数据分析选项CFX Manager软件可以自动得扣除从各个孔所得数据得基线。从菜单栏中选择S ettings,选择B ase line Thres hold可以改变基线范围。软件会自动计算基线得位置。可以点击并 拖动阀值线来手动定位。点击工具栏中View/Edit Plate按钮来编辑孔得内容，可以临时创建新得分群，从 分析中增加或删掉一些孔。图表选项可用鼠标右键点击任何图表来复制或保存图像，或选择Cha

8、rt Optio n s来改变轴范围或删 除栅格，图2、点击工具栏中 Trace Styles按钮，或鼠标右键点击任何图表来设定制定孔得荧光信号 曲线颜色。鼠标左键点击任何图表，向下与拖动光标可以放大图表。孔得分群数据浏览使用工具栏中Se lect Well Group下拉菜单来浏览指定孔得分群数据，图3。软件可以针对每个分群作为独立得实 验来处理，每一个分群可针对自己得设置进行分析,如进行自身标准曲线得分析。定量数据分析显示选项点击数据分析窗口中Quantitat i o n Data，浏览数据计算与统计,包括每 个孔得阀值（CT）与平均值以及复制得标准偏差，图4。点击任一列得标题进行基于列

9、得行分类、鼠标右键 点击电子表格并选择Sort可进行基于多个列得行分类。鼠标左键点击任一列得标题并向左或向右拖动 可以重新排列电子表格中列得顺序。鼠标右键点击电子表格,选择数据输出格式如text，XML或Exce l输 出数据，图4、从Quantita tion Data 下拉菜单中选择 Plate，在反应板栅格模式下显示所选荧光 得孔数据、，-nli-wBIKiiBIH/ H 。XJuETU-HltyTI: J JOfiEvrrsI 1 顷au, MgKlse创建报告显示选项点击数据分析窗口工具栏中 Report按钮，图1,打开Report窗口，图5、点击报告选项列表中得 检查窗，使制定信息

10、包含在报告中，这些信息在预览部分中会有所显示，图5。点击工具栏中File并选 择Save，以PDF格式保存报告，或选择Print打印报告。也可以保存报告为其它得文件格式。CFX Manag e r软件基因表达分析快速指南通过严谨得质量控制，您可以使用Gene Expression Modul e of CFX Ma nager软件来评估样品 之间靶标浓度得相对差异。这种应用最常用得使用就是评估cDNA样品中靶标得浓度来推断其mRNA水平。 通常，一个或多个参照基因得含量被用来衡量目标基因得水平。参照基因用来校正上样得差异或各样品取样 得差异。通过生物学条件得研究，参照基因得表达水平通常不发生变

11、化、基因表达分析设置图1显示各样品孔含单一得荧光，四个复制类群，包含两个不同靶标名称与两个不同得样品名称。指定参照基因Vnk-2 1Sarri&Fe 2Tvgtta品m庭1Unk-2Tar 触 1Unk-32 扣1T 2:?血一山二Unl-4 Target 2 Srriok 2Umk-1T irget 15am 口LUnki 1 LL J J I 1 - -1Unk-1T 州 gM 1Sdmote LIMo2“E国1Saenpie 2linksTdirtt 2Sample 11、点击反应板编辑器中设置窗口，图2、Exper imen t Sett i ngs 或Gene Ex pres sio

12、n Mod ule，打开实验2. 选择 Targe t s。3。点击合适得检查窗选择将被使用为参照基因得靶标。4。点击Show An alysis Setting s检查窗，为靶标设置反应扩增效率。5. Auto Eff iciency检查窗被默认设定。如果实验中运行一个标准曲线，从标准曲线中计算得到 得扩增效率将在计算中被使用。或者对合适得靶标输入指定反应扩增效率值，则计算中将使用这一扩增效率 值。指定对照样本1. 在 Experimen t Sett ings 窗口，选择 S ampl e s 标签、2. 点击合适得检查窗，选择在计算中将被作为对照得样本，图3。对每个基因来说，对照样本得值

13、被 指定为1，同时所有其她样本相对于对照样本得值会被显示出来.Lxperfment SeElings3冲HemeAFii NwwCodid1w*Otfrr2 IHfIHr厂na*mr4Sdnp?ftEW Port VllMf-ncbtJY*w L，1QvChvCVfltfa MvE*a *Aidant E w n Ar fwOjEiHBHMJheiv 7 1: 5CNtiikM1MWSKMdWLF4X，2Wr$*6wOUMa. Norm alized Expression ZlZIC(t)靶标基因得相对量可通过样本得参照基因来进行相对 量得衡量。b、相对量C(t)-靶标基因得相对量不能被衡量;

14、结果显示得就是实验中靶标基因相对于其她样品得 基因浓度、图形选项1 Gr a ph Data下拉菜单中选择对照相关或零相关得图形数据、在表中,Graph Dat a选项默认 就是对照相关、2 X轴下拉菜单中选择X轴以Sample显示或Target显示、3 Y轴下拉菜单中选择Lin ear,Log2或Log10作为Y轴刻度。4 Scaling Option 下 拉菜单中选择 Highe s t, Lowest 或 Unscaled、5 E r ror Type 下拉菜单中选择 Stand ard Error o f the Mean 或 St and a rd Deviat ion。6鼠标右键点击图形菜单选择Sort选项来指定X轴得显示顺序。7鼠标右键点击图形,复制与粘贴图形或保存图形。电子表格选项8基因表达分析结果会在电子表格中显示出来，图5。9选择任一列得标题,通过列值对数据进行分类。10鼠标右键点击电子表格，结果输出为Micro soft Exce 1电子表格或其她文件格式。