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1、第三部分仪器分析法第一章紫外分光光度法一、原理可见光、紫外线照射某些物质，主要是由于物质分子中价电子能级跃迁对辐射的吸收，而产生化合物的可见紫 外吸收光谱。基于物质对光的选择性吸收的特性而建立分光光度法或称吸收光谱法的分析方法。它是以朗伯比 耳定律为基础。1朗伯一比耳定律 A = lg - = ECL T式中A为吸收度；T为透光率；E为吸收系数，采用的表示方法是（ E；）,其物理意义为当溶液浓度为1%（g/ml）,液层厚度为1cm时的吸收度数值；C为100ml溶液中所含被测物质的重量（按干燥品或无水物计算），g;L为液层厚度，cmio二、使用范围凡具有芳香环或共轲双键结构的有机化合物，根据在特
2、定吸收波长处所测得的吸收度，可用于药品的鉴别、纯 度检查及含量测定。三、仪器可见-紫外分光光度计。其应用波长范围为 200400nm的紫外光区、400850nm的可见光区。主要由辐射源（光 源）、色散系统、检测系统、吸收池、数据处理机、自动记录器及显示器等部件组成。本仪器是根据相对测量的原理工作的，即先选定某一溶剂（或空气、试样）作为标准（空白或称参比）溶液，并认为它的透光率为 100% （或吸收度为0）,而被测的试样透光率（或吸收度）是相对于标准溶液而言，实际上就 是由出射狭缝射出的单色光，分别通过被测试样和标准溶液，这两个光能量之比值，就是在一定波长下对于被测试 样的透光率（或吸收度）。本
3、仪器可精密测定具有芳香环或共轲双键结构的有机化合物、有色物质或在适当条件下能与某些试剂作用生成有色物的物质。使用前应校正测定波长并按仪器说明书进行操作。四、仪器的校正1 .波长的准确度试验以仪器显示的波长数值与单色光的实际波长值之间误差表示，应在土1.0nm范围内。可用仪器中笊灯的 486.02nm与656.10nm谱线进行校正。2 .吸收度的准确度试验3 .杂散光的试验4 .波长重现性试验5 . 分辨率试验五、测定方法1 .对照品比较法（1）按各品种项下的方法，分别配制供试品溶液和对照品溶液，对照品溶液中所含被测成分的量应为供试品溶液中被测成分标示量的100 10%所用溶剂也应完全一致， 在
4、规定的波长测定供试品溶液和对照品溶液的吸收度后，按下式计算含量，即得。(2)计算式A样x G对/稀释倍数x 100X1含量(。% = - X 100%A对x G样/稀释倍数x 100X12 .吸收系数法(1)按各品种项下的方法配制供试品溶液，在规定的波长处测定其吸收度，再以该品种在规定条件下的吸收 系数计算含量。用本法测定时，应注意仪器的校正和检定。(2)计算式A样含量(%) = - X 100%G木丰/稀释倍数x (E；)对x 100X13 .计算分光光度法采用计算分光光度法应慎重。本法有多种，使用时均应按各品种项下规定的方法进行。当吸收度处在吸收曲线 的陡然上升或下降的部位测定时，波长的微
5、小变化可能对测定结果造成显著影响，故对照品和供试品测试条件应尽 可能一致。若测定时不用对照品，如维生素 A测定法，则应在测定时对仪器作仔细的校正和检定。六、注意事项1 .空白溶液与供试品溶液必须澄清，不得有浑浊。如有浑浊，应预先过滤，并弃去初滤液。2 .测定时，除另有规定外，应以配制供试品溶液的同瓶溶剂为空白对照，采用1cm的石英吸收池。3 .在规定的吸收峰波长士 2nm以内测试几个点的吸收度，以核对供试品的吸收峰波长位置是否正确，除另有规 定外，吸收峰波长应在该品种项下规定的波长土2nm以内；否则应考虑该试样的真伪、纯度以及仪器波长的准确度,并以吸收度最大的波长作为测定波长。4 . 一般供试
6、品溶液的吸收度读数，以在 0.30.7之间的误差较小。5 .吸收池应选择配对，否则要引入测定误差。在规定波长下两个吸收池的透光率相差小于0.5 %的吸收池作配对，在必要的情况时，须在最终测量扣除吸收池间的误差修正值。6 .由于吸收池和溶剂本身可能有空白吸收，因此测定供试品的吸收度后应减去空白读数，再计算含量。7 .仪器的接地必须良好，一切裸露的零件对地电位不得超过24伏(测电笔的就管不得发亮)。8 .在使用过程中，如需开启试样室盖时或暂时停止测试时，必须及时推入光门钮杆(使光电管前光门关闭)，保护光电管，以防止光电管受强光或长时间照射而损坏。9 .在测定时或改测其它检品时，应用待测溶液冲洗吸收
7、池34次，用干净绸布或擦镜纸擦净吸收池的透光面至不留斑痕(切忌把透光面磨损)。10 .取吸收池时，应拿毛玻璃两面，切忌用手拿捏透光面，以免粘上油污。使用完后及时用测定溶剂冲净，再用纯化水冲净，用干净绸布或擦镜纸擦干，晾干后，放入吸收池盒中，防尘保存。11 .若吸收池内外壁沾污，两池差较大的处理。(1)可用绸布缠在扁竹条外或用脱脂棉缠在细玻璃棒上蘸上乙醇，轻轻摩擦，再用纯化水冲净。(2)如上述方法处理不好，必要时可用重铭酸钾-硫酸洗液泡洗12分钟，用自来水冲净，再用纯化水冲净。(3)不得用毛刷刷洗或硬物拭擦，以防止表面光洁度受损影响正常使用。12 .请务必注意经常保持硅胶的干燥，目的是保护光学元
8、件和光电放大器系统不致受潮损坏而影响仪器的正常 工作，如发现有的硅胶由蓝色变为粉红色，应立即更换。该仪器干燥剂筒有两个：一个是装在放大器暗盒上，另一个装在单色光器暗盒上。13 .在更换硅胶干燥剂时，应关闭切断电源。14 .在停止工作期间，主机试样室内应放入袋装或筒装硅胶干燥剂。用防尘罩罩住整个仪器，并在防尘罩内放 数袋防潮硅胶。15 .仪器在操作中，狭缝的宽度应从小逐渐开大。若狭缝过大，由于进入光电管的光能量强度过大，将会使放 大器输出信号达到饱和，以至数字显示出溢出（即数字闪烁或示1不变）。这不是仪器有故障。16 .将波长旋转放在 625nm,铁缝关闭在0.02nm附近，选择按键恢复在停止工
9、作部位（即三个键均弹出）17 .搬动仪器时应搬在主体端，不要搬在试样室和光电管盒端以及光源灯室部位，以防止仪器狭缝或光路部件 受力而发生变形。并在搬动或运输时，应将可动部分固定，如各旋钮可用胶布贴住，狭缝位置开大些，然后固定， 不要关小狭缝，以免运输时振动使狭缝刀口受损坏。18 .仪器的光栅、反射镜绝对不能擦拭，否则将损坏仪器光学表面，增加杂散光。19 .仪器经过搬动请及时检查并纠正波长精度，为保证测定的准确性请经常校准波长精度。如有异常，应立即 报告质量保证部，但不得擅自调整，并及时做好记录。七、结果计算AE；: （供试品）=CLE；: （供试品）含量（ =- X 100%E；二 （标准值或
10、对照品）八、允许差仪器分析方法的误差限度，除另有规定外，其相对偏差应在土（2.03.0）%。第二章比色法一、原理及适用范围在可见光区，除某些物质有吸收外，很多物质本身并没有吸收，但可在一定条件下加入显色试剂或经过处理使 其显色后，根据颜色深浅与浓度成正比关系，则可用比色法测定含量。二、仪器可见分光光度计（或比色计）其应用波长范围为 400850nm的可见光区。主要由辐射源（光源）、色散系统（或 滤光片）、检测器系统、显示系统、记录器及吸收池等部件组成。使用前应校正测定波长并按仪器说明书进行操作。三、仪器的校正按照紫外分光光度法项下的有关规定及按仪器说明书要求进行校正。波长的准确度应在3nm范围
11、内。四、测定方法1 .用比色法测定时，应取对照品同时操作。除另有规定外，比色法所用的空白系指用同体积的溶剂代替对照品 或供试品溶液，然后依次加入等量的相应试剂，并用同样方法处理。在规定的波长处测定对照品和供试品溶液的吸 收度后，按紫外分光光度法项下“对照品比较法”的计算式计算含量。2 .当吸收度和浓度关系不呈线性时，应取数份梯度量的对照品溶液，用溶剂补充至同一体积，显色后测定各份 溶液的吸收度，然后以吸收度与相应的浓度绘制标准曲线，再根据供试品的吸收度在标准曲线上求出其含量。、注意事项测定时，应取对照品平行操作，使所用试剂用量、反应温度、酸碱度、反应时间等完全一致，对随时间变化影 响显色的品种
12、应准确控制读数时间，操作时应注意避光。第三章高效液相色谱法一、原理高效液相色谱法是用高压输液泵将具有不同极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂、缓冲液等流动相，压入装 有固定相的色谱柱，经进样阀注入供试品，由流动相带入柱内，在柱内各成分被分离后，依次进入检测器，色谱信 号由记录仪或积分仪记录。二、适用范围高效液相色谱法是一种分离分析方法，适用于挥发性低、热稳定性差、分子量大的高分子化合物以及离子型化 合物等的定性、定量分析。中国药典主要用于药品的含量测定、有关物质检查、杂质限度检查和鉴别等。三、仪器高效液相色谱仪主要由输液泵系统、进样器系统、色谱柱、检测器、记录器、显示器及数据处理机（或兼有组 分
13、收集系统）等组成。使用时应按仪器的说明书进行操作。四、仪器的校正1 .高效液相色谱仪的柱箱控温精度、基线噪声、基线漂移、灵敏度或检测限、线性范围的检定均按仪器说明书 的技术要求进行校验，应符合规定。2 .以紫外-可见光检测器、荧光检测器、差示折光检测器为检测器的实验室通用液相色谱仪的检定，所用各种 标准物质应使用经国家技术监督部门批准颁发的标准物质。具体校正方法和主要技术指标见“高效液相色谱仪检测 器的校验”。3 . 泵的耐压试验4 .泵流量设定值误差、流量稳定性误差的试验5 .柱恒温箱温度设定值误差和控温稳定性误差的试验6 .梯度准确度的试验7 . 定性定量重现性的试验五、对仪器的一般要求1
14、 .色谱柱的填充剂和流动相的组分应按各品种项下的规定。常用的色谱柱填充剂有硅胶（正相色谱）和化学键 合硅胶，后者以十八烷基硅烷键合硅胶（反相色谱）最为常用，辛基硅烷键合硅胶次之，鼠基或氨基键合硅胶也有 使用。离子交换填充剂用于离子交换色谱；凝胶或玻璃微球等填充剂用于分子排阻色谱等。除另有规定外，柱温为 室温，检测器为紫外吸收检测器。2 .药典正文中各品种项下规定的条件除固定相种类、流动相组分、检测器类型不得任意改变外，其余如色谱柱 内径、长度、固定相牌号、载体粒度、流动相流速、混合流动相各组分的比例、柱温、进样量、检测器的灵敏度等, 均可适当改变，以适应具体品种并达到系统适用性试验的要求。3
15、. 一般色谱图约于20分钟内记录完毕。六、系统适用性试验按各品种项下要求对仪器进行适用性试验，即用规定的对照品对仪器进行试验和调整，应达到规定的要求，或 规定分析状态下色谱柱的最小理论板数、分离度、重复性和拖尾因子。1 .色谱柱的理论板数（n）.2n = 5.54（tr/WA/2）2式中t R为保留时间（以分钟或长度计，下同，但应取相同单位）；W h/2为半峰高宽。2 .分离度（R）除另有规定外，分离度应大于1.5。2（tR2一 t R1）R =-W1 + W2式中t R2为相邻两峰中后一峰的保留时间；tR1为相邻两峰中前一峰的保留时间；W i及W2为此相邻两峰的峰宽。3 . 重复性取各品种项下的对照溶液，连续进样 5次，除另有规定外，其峰面积测量值的相对标准偏差应不大于2.0%。也可按各品种校正因子测定项下，配制相当于 80% 100崎口 120%勺对照品溶液，加入规定量的内标溶液，配成 3种不 同浓度的溶液，分别进样 3次，计算平均校正因子，其相对标准偏差也应不大于2.0%。4 . 拖尾因子（T）除另有规定外，T应在0.951.05之间。W 0.05hT =-2d
