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1、- 毕业论文题 目乙肝外表抗原的ELISA法定量分析方法学验证年 级2021级层次专科专 业临床医学班级一班姓 名学号指导教师职称 2014年5月6日XX医学院继续教育学院制-目 录摘要关键词英文前 言1. 材料与方法1.1 试剂盒1.2 仪器1.3 方法1.3.2铺板方案1.3.3加样步骤2. 结果2.1 标准曲线与线性X围2.2 准确度回收率的验证2.3 精细度的验证2.3.1 板内精细度的验证2.3.2 板间精细度的验证2.4 检测限LOD计算3. 讨论3.1 乙肝外表抗原定量分析的意义3.2 常用定量分析方法3.3 方法概述3.4 方法学验证内容3.5 结果分析及应用评价参考文献致谢附
2、录乙肝外表抗原的ELISA法定量分析方法学验证摘 要目的：对XX蓝图生物工程生产的HBsAg的ELISA法定量分析试剂盒进展方法学验证，以判断是否能用于临床样本分析。方法：ELISA法定量分析，应用试剂盒HBsAg标准品从浓度为8ng/ml做2倍稀释的6个浓度梯度做标准曲线，以6，3，1.5ng/ml 3个浓度梯度5复孔做准确度，精细度和检测限等方法学验证。结果：标准曲线R2=0.997，准确度97.07%，1.5ng/ml的RSD为16.78%，不满足ng/ml级水平的RSD一般应15%的要求，检测限LOD为0.172ng/ml，低浓度样品1.5ng/ml的检测在准确性和精细度方面都低于高浓
3、度样品，不适合低浓度样品的检测。结论：该HBsAg的ELISA法定量分析试剂盒不能用于临床标本的分析。关键词乙肝外表抗原 ELISA 定量分析 方法学验证The reification of the HBsAg ELISA quantitative methodologyAbstractObject: to verify the quantitative methodology of Fuzhou blueprint biological engineering company to make sure whether it ca be used to the analysis of Clin
4、ical Sample. Methods: ELISA quantitative methodology , make an Application of the standard HBsAg kit from the concentration of 8 ng/ml do 2 times diluted six concentration gradient to constitute a standard curve, testing With 6, 3, 1.5 ng/ml 3 a concentration gradient 5 accurately precise and detect
5、ion .Results: standard curve ,R2=0.997, the accuracy of RSD of 1.5ng/m is 16.78%，the RSD that cannot meet the demand of ng/ml basic level is less than 15% in common. The LOD is 0.172ng/ml, the testing of Low concentration samples 1.5ng/mlare lower than high concentration samples in both accuracy and
6、 precision , which as a result make it unsuitable for low concentration sample testing. Conclusion: the ELISA quantitative analysis kit of HBsAg cannot be used for the analysis of Clinical Sample.Key wordsHBsAg Quantitative analysis Verification Methodology.前 言乙肝病毒感染是我国最常见的感染性疾病之一，而乙型肝炎血清标志物是检测乙肝病毒感
7、染最主要的病原标志。随着免疫学技术的不断开展，抗原抗体检测灵敏度明显提高，使低水平乙肝病毒得以检出，对临床诊断及流行病学有重要意义1。ELISA法具有较高灵敏度、特异性强、重复性好、可进展定量和半定量测定等优点，可以在酶免疫分析仪上做批量检测。目前临床上多倾向于做定量分析，假设想知道检验结果是否可靠，实验室那么必须对所用试剂盒进展方法学验证，本实验对XX蓝图生物工程生产的HBsAg的ELISA法定量分析试剂盒进展准确度，精细度和检测限等方法学验证，现报告如下。1. 材料与方法1.1 试剂盒 乙肝外表抗原ELISA法定量分析试剂盒，XX蓝图生物工程出品。1.2 仪器酶标仪：Bio-Rad 680
8、 ；洗板机：Bio-Rad 1575；超纯水系统：Millipore Elix ；电热恒温培养箱(DNP-9052)XX精宏实验设备；振荡器XX管械，KJ-201A；移液器；Tip头；EP管。1.3 方法1.3.1溶液配置 1PBS缓冲液的配置： 称取8g NaCl、 0.2g KCl、1.44g Na2HPO4和0.24g KH2PO4，溶于800ml蒸馏水中，用HCl调节溶液的pH值至7.4，最后加蒸馏水定容至1L即可。标准品的配置：原始标准品浓度为8 ng/ml。取6个2mlEP管，分别标记为S1-S6。50ul/well, 共1孔需50ul，每孔配置60ul备用，按照下表稀释方案进展稀
9、释。编号终浓度 ng/ml预加1PBS取剩余ul标记ulS180标准品120S2460S16060S3260S26060S4160S36060S50.560S46060S60.2560S56060 质控品的配置：50ul/well, 共5复孔需250ul，配置300ul备用，取3个2mlEP管，分别标记为C1，C2，C3，按照下表稀释方案进展稀释。编号终浓度 ng/ml预加1PBS取剩余ul标记ulC16150标准品450C23300C1300300C31.5300C23003001.3.2铺板方案 取出试剂盒中已包被酶标板，取出板条，按照下表铺板方案进展铺板在相应孔中依次参加系列标准品、质控
10、品及空白对照，每孔50ul。空白对照参加1PBS缓冲液。1.3.3加样步骤参加酶标抗体，50 ul/well，震荡。37电热恒温培养箱温育60min，取出后洗板4次， 参加A、B液, 50 ul/ well，37电热恒温培养箱温育15 min。参加终止液，50 ul/ well。酶标板放入酶标仪，盖上盖子，在电脑上翻开Microplate Manager 5.2软件，选择450nm波长参照波长630nm，设置LAYOUT和报告模式，测定各孔吸收值。2. 结果2.1 标准曲线与线性X围标准品理论浓度对应的实测OD值以HBsAg理论浓度为横坐标，所测OD值为纵坐标作图，绘制标准曲线观察线性关系，结
11、果显示R2=0.9973，显示具有良好的相关性2.2 准确度回收率的验证 质控品理论稀释浓度对应实测浓度值质控品做了3个浓度梯度，每个浓度做了5个复孔，下表是对每个浓度梯度进展准确度回收率的验证。结果显示HBsAg 6ng/ml和3ng/ml的平均回收率为97.58%，113.07%，满足限度要求在85%-115%的X围内，而HBsAg 1.5ng/ml的平均回收率为80.56%，满足方法定量限在80%-120%的X围内。3个浓度梯度的平均回收率为97.7%，显示准确性好。2.3精细度的验证2.3.1 板内精细度的验证上表中RSD(%)这一参数表示相对标准偏差，也就是变异系数CV值，HBsAg
12、 6ng/ml的5个复孔的变异系数CV值为12.73%，显示孔间差异较大，精细度不高，但是也符合ng/ml级RSD水平的一般应15%的要求，其中有一孔浓度为4.55，与其它孔比较差异较大，可能是由于操作引起例如加样不准。而3ng/ml,和1.5ng/ml的变异系数CV为3.5%，3.7%，符合显示孔间重复性好，符合ng/ml级RSD水平的一般应15%的要求，精细度高。2.3.2 板间精细度的验证 从同一实验室中获取2组同样的数据，做板间精细度的验证。首先对同一实验条件下不同实验人员所获得的数据是否可用于板间分析做验证。以HBsAg理论浓度为横坐标，所测OD值为纵坐标作图，绘制标准曲线观察线性关
13、系。以上标准曲线结果显示第二组数据的R2 =0.967，第三组数据R2 =0.991。第二组数据由于有一些孔与标准曲线偏离较大，但考虑到随机抽样与均数存在一定误差，还是可以用于统计学分析。下表对3组数据做板间分析。从表中3个组的数据比较可知，HBsAg 6ng/ml和3ng/ml的RSD分别为9.10%，12.06%，满足对ng/ml级水平的RSD一般应15%的要求，精细度高。而HBsAg 1.5ng/ml的RSD为16.78%，不满足ng/ml级水平的RSD一般应LOD，此标准曲线上最低浓度点为0.25，大于LOD0.172，故此标准曲线线性好。3. 讨论3.1 乙肝外表抗原定量分析的意义乙肝外表抗原是乙肝两对半的其中一项，乙肝两对半定性检测对乙肝疾病的诊断，病情监测，疗效观察起到了一定的作用。但随着临床医学的开展，乙肝两对半定性检测已经远远不能满足临床及患者的要求，特别是在疗效观察以及乙肝疫苗注射后抗体产生情况的观察上有明显的缺乏。随着检验医学的开展，乙肝两对半定量测定成为可行，大大弥补了乙肝两对半定性检测的缺乏。而且乙肝两对半定量检测可与HBV DNA荧光测定相互补充，综合评价患者病情与药物疗效，为低含量的慢性乙肝、病毒携带者提供了正确判断病情的依据【2】。这在目前的临床治疗中应用十分广泛。3.2
