DNA提取中各种实验试剂作用原理

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1、DNA提取中各种实验试剂作用原理DNA提取中各种实验试剂作用原理1、STE是Tris-Hcl、EDTA、Nacl的混合液。其总体作用是为DNA提供保护环境，在此环境下 DNA 可以呈稳定态，最少限度地受到破坏。提供缓冲体系，DNA在这一体系中呈稳定态。EDTA :是DNA酶的抑制剂，可以防止细胞破碎后DNA酶降解DNA。NaCl，有利于DNA的溶解。2、SDS的作用：利用高浓度的阴离子去垢剂SDS （十二烷基磺酸钠，Sodium dodecyl sulfate）使DNA与蛋白质分离，在高温（55 65C。）条件下裂解细 胞，使染色体离析，蛋白变性，释放出核酸，然后采用提高盐浓度及降低温度 的方

2、法使蛋白质及多糖杂质沉 淀，离心后除去沉淀，3、苯酚的作用：使蛋白质变性，同时抑制了 DNase的降解作用。用苯酚处理匀 浆液时，由于蛋白与DNA联结键已断，蛋白分子表面又含有很多极性基团与苯 酚相似相溶。蛋白分子溶于酚相，而DNA溶于水相。使用酚的优点：1.有效变性蛋白质；2.抑制了 DNase的降解作用。缺点：1. 能溶解10-15%的水，从而溶解一部分poly （A） RNA。2.不能完全抑制RNase 的活性。Tris酚的颜色，一般为黄色。如果变成粉红色，说明被氧化，不能再用。4、氯仿的作用克服酚的缺点；加速有机相与液相分层。最后用氯仿抽提：去除核酸溶液中的迹量酚。（酚易溶于氯仿中）5

3、、异戊醇：减少蛋白质变性操作过程中产生的气泡。异戊醇可以降低表面张 力，从而减少气泡产生。另外，异戊醇有助于分相，使离心后的上层含 DNA 的 水相、中间的变性蛋白相及下层有机溶剂相维持稳定。6、用乙醇沉淀 DNA 时，为什么加入单价的阳离子用乙醇沉淀DNA时，通常要在溶液中加入单价的阳离子，如NaCl或NaAc, Na+中和DNA分子上的负电荷，减少DNA分子之间的同性电荷相斥力，而易于聚 集沉淀。7 为什么在保存或抽提DNA过程中，一般采用TE缓冲液在基因操作实验中，选择缓冲液的主要原则是考虑DNA的稳定性及缓冲液成分 不产生干扰作用。磷酸盐缓冲系统(pKa二)和硼酸系统(pKa=)等虽然

4、也都符 合细胞内环境的生理范围(pH)，可作DNA的保存液，但在转化实验时，磷酸根 离子的种类及数量将与Ca2 +产生Ca3(P04)2沉淀，在DNA反应时，不同的酶 对辅助因子的种类及数量要求不同,有的要求高离子浓度,有的则要求低盐浓 度，采用Tris-HCl (pKa=)的缓冲系统，由于缓冲液是TrisH+/Tris，不存在 金属离子的干扰作用，故在提取或保存DNA时，大都采用Tris-HCl系统，而 TE缓冲液中的EDTA更能稳定。8、STE是Tris-Hcl、EDTA、Nacl的混合液。其总体作用是为DNA提供保护 环境，在此环境下DNA可以呈稳定态，最少限度地受到破坏。提供缓冲体系，

5、DNA在这一体系中呈稳定态。EDTA :是DNA酶的抑制剂，可以防止细胞破碎后DNA酶降解DNA。NaCl，有利于DNA的溶解。9、SDS的作用：利用高浓度的阴离子去垢剂SDS （十二烷基磺酸钠，Sodium dodecyl sulfate）使DNA与蛋白质分离，在高温（55 65C。）条件下裂解细胞，使染色体离析，蛋白变性，释放出核酸，然后采用提高盐浓度及降低温度 的方法使蛋白质及多糖杂质沉 淀，离心后除去沉淀，10、苯酚的作用：使蛋白质变性，同时抑制了 DNase的降解作用。用苯酚处理 匀浆液时，由于蛋白与DNA联结键已断，蛋白分子表面又含有很多极性基团与 苯酚相似相溶。蛋白分子溶于酚相，

6、而DNA溶于水相。使用酚的优点：1.有效变性蛋白质；2.抑制了 DNase的降解作用。缺点：1.能溶解10-15%的水，从而溶解一部分poly （A） RNA。2.不能完全抑 制 RNase 的活性。Tris酚的颜色，一般为黄色。如果变成粉红色，说明被氧化，不能再用。11、氯仿的作用克服酚的缺点；加速有机相与液相分层。最后用氯仿抽提：去除核酸溶液中的迹量酚。（酚易溶于氯仿中） 5、异戊醇：减少蛋白质变性操作过程中产生的气泡。异戊醇可以降低表面张 力，从而减少气泡产生。另外，异戊醇有助于分相，使离心后的上层含DNA的 水相、中间的变性蛋白相及下层有机溶剂相维持稳定。12、用乙醇沉淀DNA时，为什

7、么加入单价的阳离子用乙醇沉淀DNA时，通常要在溶液中加入单价的阳离子，如NaCl或NaAc,Na+中和DNA分子上的负电荷，减少DNA分子之间的同性电荷相斥力，而易于聚 集沉淀。Tris中文品名: 三羟甲基氨基甲烷; 氨基丁三醇; 缓血酸胺Tris 结构式 英文品名: Tris; Tris(Hydroxymethyl)aminomethane英文别名: 2-Amino-2-(hydroxymethyl)-1,3-propanediolTHAM; Tris base; Trometamol通用 CAS : 77-86-1产品纯度: 100%(USP 药典级) / %(实验室技术级)产品级别：US

8、P药典级，符合USP/EP/cGMP对药物赋形剂的要求分 子 式: NH2C(CH2OH)3分 子 量：使用用途： 生物制药， 体外诊断， 个人护理及化妆品原料等保存温度： 常温密封避光保存TRIS 是一种最常用的生物缓冲液，常配成 PH 值为，。其 PH 值随温度变化很大。一般来说，温度每升高一度，PH值下降。1M TRIS-HC1 和 1.5M TRIS-HC1 是 SDS-PAGE 最常用的试剂。而由TRIS配成的TAE，TBE等是DNA电泳最常用的试剂，TE ()主要用于溶解DNA。 TE 为 Tris 加 EDTA 合称。缓冲特性:Tris为弱碱，在室温(25C。)下，它的为；根据缓

9、冲理论，Tris缓 冲液的有效缓冲范围在到之间。Tris碱的水溶液pH在左右，一般加入盐酸以 调节pH值至所需值，即可获得该pH值的缓冲液。但同时应注意温度对于Tris 的 pKa 的影响。衍生缓冲液：由于Tris缓冲液为弱碱性溶液，DNA在这样的溶液中会被去质子化，从而提高 其溶解性。人们常常在Tris盐酸缓冲液中加入EDTA制成“TE缓冲液”，TE缓 冲液被用于DNA的稳定和储存。如果将调节pH值的酸溶液换成乙酸，则获得“TAE缓冲液” (Tris/Acetate/EDTA)，而换成硼酸则获得“TBE缓冲液” (Tris/Borate/EDTA)。这两种缓冲液通常用于核酸电泳实验中。制备：Tris可以由两步反应生成：先由硝基甲烷生成中间体三羟甲基硝基甲烷 (H0CH2)3CN02)，然后再由该中间体还原得到Tris。用途：Tris缓冲液不仅被广泛用作核酸和蛋白质的溶剂，还有许多重要用途。Tris被用于不同pH条件下的蛋白质晶体生长。Tris缓冲液的低离子强度特点 可用于线虫(C. elegans)核纤层蛋白(lamin)的中间纤维的形成。Tris也 是蛋白质电泳缓冲液的主要成分之一。此外，Tris还是制备表面活性剂、硫化 促进剂和一些药物的中间物。Tris也被用作滴定标准物。