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1、械IB榊养祉学删牍删组员：刘炎炎吴颖川邹琳 张雪娇顾琦欣一实验目的了解原代细胞培养的基本方法及操作过程。学习细胞计数、营养液的配制等，初步掌握 无菌操作方法。以及观察LPS和PHA对细胞生长的影响。二实验原理（一）细胞原代培养原代细胞培养是指直接从动物体内获取的细胞、组织和器官，经体外培养后，直到第一次传 代为止。这种培养，首先用无菌操作的方法，从动物体内取出所需的组织（或器官），经消 化，分解成单个游离细胞，在人工培养下，使其不断的生长及繁殖。细胞培养是一种操作繁琐而又要求十分严谨的实验技术。要使细胞能在体外长期生长，必须 满足两个基本要求：一是供给细胞存活所必须的条件，如适量的水、无机盐、
2、氨基酸、维生 素、葡萄糖及其有关的生长因子、氧气、适宜的温度，注意外环境酸碱度与渗透压的调节。 二是严格控制无菌条件。（二）细胞死活鉴定死活细胞的鉴定方法有很多种，常用的有染色法和仪器分析法。染色法是常用的细胞死活鉴 定方法，简便，易于操作。不同的死活细胞鉴定方法有各自不同具体的反应机理，但无论采 用何种办法，都是利用了死活细胞在生理机能和性质上的差异。染色法分化学染色法和荧光染色法，根据染色机理的不同，染料或使死细胞着色，或使活细 胞着色。死活细胞在生理机能和性质上的差异主要包括：死活细胞细胞膜通透性的差异:活细胞的细胞膜是一种选择性膜,对细胞起保护和屏障作用， 只允许物质选择性的通过；而细
3、胞死亡之后，细胞膜受损，通透性增加。常用的以台盼蓝鉴 别细胞死活的方法就是利用了这一性质。台盼蓝，又称锥蓝，是一种阴离子型染料，不能透 过完整的细胞膜。所以经台盼蓝染色后只能使死细胞着色，而活细胞不被着色。甲基蓝有类 似的染色机理。植物细胞的质壁分离也可鉴定死活。死活细胞在代谢上的差异:是采用美蓝染料鉴定酵母细胞死活的依据。美蓝是一种无毒染料， 氧化型为蓝色，还原型为无色。由于活细胞中新陈代谢的作用，使细胞内具有较强的还原能 力，能使美蓝从蓝色的氧化性变为无色的还原型，因此美蓝染色后活的酵母细胞无色；而死 细胞或代谢缓慢的老细胞，则因它们的无还原能力或还原能力极弱，使美蓝处于氧化态，从 而被染
4、成蓝色或淡蓝色。除此之外，还有一些细胞器的专有染料。如液泡系的专有染料中性红。中性红是一种低毒性 染料，可以使活细胞液泡着红色，而细胞质和细胞核不被着色；死细胞的液泡不被着色或浅 染，染料弥散于整个细胞中，细胞核和细胞质被染成红色。有时侯为了增加染色效果可以将 两种染料结合使用，如甲基蓝-中性红混合染色法。（三）化学试剂LPS：脂多糖，脂质和多糖的复合物，为革兰氏阴性细菌细胞壁的主要成分，大肠杆菌的脂 多糖在实验室是常用的B细胞促分裂因子。但是高浓度的LPS会抑制淋巴细胞的增长。PHA：植物血凝素，是一种有丝分裂原，能激活小淋巴细胞转化为淋巴母细胞，继而分裂增 殖，释放淋巴因子。但是高浓度的P
5、HA会抑制淋巴细胞的增长。（四）MTT法MTT全称为3-（4, 5-二甲基噻唑-2）-2, 5-二苯基四氮唑溴盐，商品名：噻唑蓝。是一种黄颜 色的染料。MTT比色法，是一种检测细胞存活和生长的方法。其检测原理为活细胞线粒体 中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒并沉积在细胞中，而 死细胞无此功能。二甲基亚砜（DMSO）能溶解细胞中的甲瓒，用酶联免疫检测仪在570nm波长处测定其光吸收值，可间接反映活细胞数量。在一定细胞数范围内，MTT结晶形成的 量与细胞数成正比。该方法已广泛用于一些生物活性因子的活性检测、大规模的抗肿瘤药物 筛选、细胞毒性试验以及肿瘤放射敏感性测定等。
6、它的特点是灵敏度高、经济。缺点：由于 MTT经还原所产生的甲瓒产物不溶于水，需被溶解后才能检测。这不仅使工作量增加，也 会对实验结果的准确性产生影响，而且溶解甲的有机溶剂对实验者也有损害。三实验器材剪子，棉球，75%酒精，移液枪，无菌操作台，光学显微镜，解剖盘，离心管，离心机， 注射器，Eppendorf管，培养皿，酒精灯，塑料培养皿，载玻片，盖玻片，血细胞计数板等。四实验材料小鼠1只，细胞培养液（含生长因子），Trypen Blue染液，PBS缓冲液，LPS, PHA, MTT， DMSO。五实验步骤（一）细胞的原代培养1取材：取小鼠一只，采用颈椎脱臼处死。清水洗小鼠浸入75%酒精中消毒5m
7、in，取出转入超净工 作台内的解剖盘中，无菌操作打开腹腔，取出其脾脏，除去其周围的脂肪组织，并用PBS 液自上而下淋洗1-2次。2分离脾细胞：将取出的脾脏细胞置于含有滤器的培养皿内，向脾脏上滴加500微升PBS溶液，用注射器 柄将其杵烂至至匀浆状态，加入500微升PBS溶液冲洗细胞筛，将获得的溶液中含有可见 组织的重新转到筛上过滤。将获得的1mL脾细胞匀浆转入10 mL离心管中，加入三倍体积 的红细胞裂解液，混匀，1000rpm / 5 min.离心弃红色上清。加入3 ml PBS再洗2次。3培养脾细胞：取塑料培养皿一套，用移液枪吸取培养液（RPMI-1640 （Invitrogen） +10
8、% 胎牛血清FBS （GIBCO） +1%双抗P/S （GIBCO） 一2mL加入塑料皿中，并将皿标记待用。取离心后的Eppendorf管，弃去上清液，用移液枪（200u 1）吸取塑料皿中的培养液400ul加入弃去上清 的Eppendorf管中，用枪头吹匀管底的脾细胞，吸取200u1脾细胞悬液接种于上述塑料皿中， 混匀后放入37 C，5%CO2的培养箱中培养。（TB细胞是悬浮生长的：108是接种塑料皿 的浓度，106是接种96孔板的浓度）（二）细胞死活鉴定及计数1. 试剂配制：用生理盐水配成4%Tyrpen Blue染液，备用。使用时稀释至0.4%。2. 染色计数：取0.5mL细胞悬浊液放入试
9、管中，加入1-2滴染液。混合。2-5min后将细胞放在血细胞计 数板上观察死活情况，注意不要有气泡产生，放大倍数为10x10。染色后活细胞不着色，死 细胞显示蓝色。注意染色时间不能超过15min，否则染液将细胞毒杀。3. 计数：在10x10倍的显微镜下观察，计算血细胞计数板的4个4小方格的细胞数量。包括细胞总数 与死细胞数量。压线者计上不计下，计左不计右。（三）MTT法分析细胞增殖将1 X 106 / mL脾脏细胞悬液，接种于96孔细胞培养板上，每孔加入200 “L细胞悬液， 按照实验设计分组，每个样品3个重复孔，在37C、5% CO2的培养箱里培养24、48、72 h后，离心后小心弃去上清液
10、，每孔加入20p L MTT （ 5 mg / mL），继续培养4 h,然后每孔 加入150 p L DMSO，振荡10 min后，测定570 nm处的吸光值，计算细胞存活率。（五）将脾脏细胞悬液稀释至1 X 106/ mL，接种于96孔细胞培养板上，每孔加入200 p L细胞悬液（除第二列），外围加上PBS缓冲液，第二列加入细胞培养液，第三列加入200 p L脾细胞，第四列加入200 p L脾细胞和20 p g / mL的LPS，第五列加入200 p L脾细 胞和 2 p g / mL 的 PHA。六实验结果分析0. 50. 30. 20. 1blankPHA.A570 - 72 h图一 L
11、PS对小鼠脾细胞增殖的影响72 h图二PHA对小鼠脾细胞增殖的影响由上述图表可知，LPS对细胞增殖起到了抑制作用，而PHA则起到了促进作用。由于适当 浓度的LPS和PHA都能起到促进细胞增殖的作用，LPS主要刺激B细胞增殖，PHA主要 刺激T细胞增殖。而图一中LPS反而起到抑制脾细胞增长的作用，这是由于高浓度的LPS 会抑制细胞增长。20 p g / mL的LPS对于1 X 106/ mL脾脏细胞悬液而言浓度偏高了。 而一定浓度的PHA能刺激T细胞增殖，在脾脏细胞中B细胞60%, T细胞40%，虽然B细 胞占优势，但T细胞也不少，所以过了三天后，细胞数量还是明显增加了。七思考为什么老师在实验前所说的结果是LPS促进细胞生长，PHA抑制细胞生长?大肠杆菌的脂多糖在实验室是常用的B细胞促分裂因子。植物血凝素是一种有丝分裂原，能激活小淋巴细胞转化为淋巴母细胞，继而分裂增殖，释放 淋巴因子。PHA刺激T细胞增殖分化产生大量效应T细胞和细胞毒T细胞；PHA同时可刺 激B细胞转化为浆母细胞然后增殖分化为浆细胞。高浓度的LPS和PHA都会抑制细胞增长，合适浓度的LPS和PHA都能促进细胞增殖。 所以最后的结果应该是取决于两种化学试剂的浓度。
