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1、0.001的分层液为佳。Ficoll别离液法主要用于别离PBMCs，是一种单次差速密度梯度离心法。聚蔗糖-泛影葡胺是一种较理想的细胞分层液，商品名Ficoll。别离时先将分层液置试管底层，然后将肝素抗凝全血以Hanks液或PBS液做适当稀释后，轻轻叠加在分层液的上面，使两者形成一个清晰的界面。水平式离心后，离心管中会出现几个不同层次的液体和细胞带：由于红细胞和粒细胞比重大于分层液，同时因红细胞在Ficoll液中凝聚成串而沉于管底，血小板那么因密度小而悬浮于血浆中，只有与分层液密度相当的单个核细胞密集在血浆层和分层液的界面之中，呈白膜状为白膜层。吸取该层细胞，经洗涤离心重悬即为单个核细胞。本法别
2、离单个核细胞纯度可达95%，淋巴细胞约占9095 %，细胞收率可达80%以上，但室温超过25时可影响细胞收率。辅助性T细胞的典型外表标志：CD3+CD4+CD8+。Th1主要分泌IL-2，IFN-或TNF-等辅助细胞免疫或参与迟发型超敏反响；Th2主要分泌IL-4/5/6/10等辅助体液免疫、参与速发型超敏反响细胞毒性T细胞的典型外表标志是CD3+CD4-CD8+。CD3+CD8+CD30-可认定为Tc1细胞；CD3+CD8+CD30+可认定为Tc2调节性T细胞：自然存在的，其典型标志为CD4+CD25+Foxp3+ 最重要的分子标记是一种转录因子Foxp3成熟B细胞均表达CD19，B1细胞C
3、D19+CD5+，B2细胞CD19+CD5-NK细胞的典型标志：CD3-CD16+CD56+。单核-巨噬细胞的典型外表标志为CD14。人成熟DC的主要特征外表标志为CD1a、CD11c和CD83，但不表达MPS、T/B/NK细胞的典型外表标志CD14/3/19和CD20/16/56。T细胞增殖试验有：形态学检查法，3H-TdR掺入法、MTT比色法溶血空斑实验PFC：将经SRBC免疫过的小鼠脾细胞与一定量的SRBC混合，在补体参与下，使抗体形成细胞周围那些受到抗体分子致敏的绵羊红细胞溶解，形成肉眼可见的溶血空斑，每一个空斑中央含一个抗体形成细胞，空斑数目即为抗体形成细胞数目。细胞因子CK：是由机
4、体活化的免疫细胞及某些基质细胞分泌的小分子蛋白质，通过结合细胞外表的相应受体发挥生物学效应有旁分泌、自分泌、内分泌。细胞粘附分子CAM：是由细胞产生、介导细胞与细胞间或细胞与基质间相互接触和结合的分子。酶联免疫斑点实验ELISPOT：在包被有待测CK抗体的微孔板上，参加可分泌相应细胞因子的待测细胞，在有或无刺激物存在的条件下培养后，待测细胞向其周围分泌细胞因子，并被板上的特异性抗体捕获。洗去细胞后用酶标抗体为一抗或二抗，分别做直接法和间接法。所选底物应在酶促反响后形成不溶性产物。一个斑点代表一个细胞因子分泌细胞，斑点的颜色深浅程度与细胞因子量相关。 免疫球蛋白(Ig)：是指具有抗体活性或化学构
5、造与抗体相似的球蛋白。可分为分泌型和膜型两类。现在认为，Ig与Ab没有什么区别临床上常用速率散射免疫比浊法检测Ig。选择性蛋白尿指数SPI：SPI0.2为选择性蛋白尿， 肾小球损害较轻如微小病变肾病，治疗反响和预后大多较好；SPI0.2为非选择性蛋白尿， 肾小球损害较重如膜性肾病、膜增殖性肾炎与肾病综合征，预后大多不良。M蛋白MP：是B淋巴细胞或浆细胞单克隆异常增殖所产生的一种在氨基酸组成及顺序上十分均一的异常单克隆Ig。本周蛋白：即尿液中游离的免疫球蛋白轻链。补体：是存在于人和动物血清、组织液和某些细胞膜上的一组经激活后具有酶活性的、不耐热的蛋白质。血液中大局部补体由肝脏合成，均为糖蛋白，多
6、为球蛋白，少数为/球蛋白；其中C3含量最高1.2g/L，D因子含量最低12mg/L。补体应保存于-20以下56加热30min即可灭火，常温下很快失活经典途径MBL途径旁路途径激活物质抗原抗体复合物MBL相关丝氨酸蛋白酶肽聚糖、酵母多糖、脂多糖起始分子C1qC2、C4C3参与成分C1、C4、C2、C3C4、C2、C3、MASPC3、B因子、D因子共同末端C5C9C5C9C5C9所需离子Ca2+，Mg2+Ca2+Mg2+C3转化酶C4b2bC4b2bC3bBbpC5转化酶C4b2b3bC4b2b3bC3bnBbp是否依赖Ab是否否生物学作用参与特异性免疫的效应阶段，于感染后期发挥作用参与非特异性免
7、疫的效应阶段，于感染早期发挥作用参与非特异性免疫的效应阶段，于感染早期发挥作用补体的生物学功能： 溶解细胞/细菌/病毒、调理作用、去除免疫复合物、引起炎症反响、免疫调节作用补体CH50实验：补体与抗体溶血素致敏的羊红细胞接触后，被激活C1、经典途径，从而使致敏的SRBC溶解，在特定体系中，其溶血程度与补体量呈正比。因此，将新鲜待检血清做不同稀释后，与致敏红细胞反响，测定溶血程度，以50%溶血时的最小血清量判定终点，可测知补体总溶血活性。以50%溶血判断结果比100%溶血灵敏、准确。 补体结合试验CFT利用抗原抗体复合物可激活补体的特点，用一定量的补体和致敏的SRBC来检测有无抗原抗体特异性结合
8、的方法。 试验中有5种成分参与反响，分属3个系统：1、反响系统：抗原或抗体与待测抗体或抗原2、指示系统：绵羊红细胞与相应溶血素结合，成为致敏绵羊红细胞。3、补体系统常用豚鼠新鲜血清。反响系统与补体系统先发生反响，然后再参加指示系统，根据致敏绵羊红细胞有无溶血来判断实验结果。不溶血为阳性+ ，溶血那么为阴性- 肝炎病毒感染 一甲型肝炎病毒感染主要经粪-口传播，其实验室诊断主要依赖血清中特异性抗体的检测，通常呈采用ELISA和化学发光技术对HAV IgG及IgM进展检测。HAV IgM在急性感染时出现较早发病后14周，上升快，顶峰效价高，持续时间短常于36个月后转阴，是急性HAV感染或复发的可靠指
9、标，并且有助于区分现症感染和既往感染。HAV IgG一般于感染4周后出现，24周达顶峰，可维持多年甚至终生。二乙型肝炎病毒感染1、HBsAg乙肝病毒外表抗原：可采用固相RIA、ELISA、反向间接血凝实验等方法检测，是乙型肝炎早期诊断的重要指标。目前可采用CLIA对血清中的HBsAg进展定量检测，对肝炎患者动态评价病情与药物疗效很有价值。乙型肝炎外表抗原，存在于HBV的外壳局部。血清中检出HBsAg是乙肝的早期诊断指标之一，是乙肝患者血清中首先出现的病毒标志物，急性肝炎潜伏期即可出现养性，先于患者临床病症级肝功能异常如血清转氨酶ALT升高17周，到恢复期HBsAg滴度逐渐降低乃至消失。仅为HB
10、V感染的标志，不反映病毒有无复制、复制程度及预后。 2、HBsAb乙肝病毒外表抗体：是一种保护性抗体，也是机体感染或接种乙肝疫苗的标志。目前常用固相RIA与ELISA法检测之。承受HBV疫苗接种后，血清中可出现HBsAb阳性。作为疫苗免疫机体产生的抗体，对HBV的感染具有保护性免疫作用。乙肝疫苗接种者一旦出现除抗HBs以外的标志物，那么应视为既往感染。 HBsAb阳性可提示急性感染后的恢复期。3、HBeAg乙肝病毒e抗原：为病毒复制标志，多存在于HBsAg阳性的标本中，急性乙肝患者血清HBeAg持续阳性3个月以上，那么有疾病慢性化倾向。在血清中的出现时间稍后于HBsAg，是HBV复制活泼的血清
11、学指标，其水平与病毒复制、肝脏损害程度成正比，因此HBeAg是乙肝患者有较强传染性的标志。4、HBeAb乙肝病毒e抗体：多出现于急性肝炎恢复期的患者中，比HBsAb转阳要早，常在HBsAg即将消失或已经消失时检出，可长期存在。当血清HBeAg转阴后，可出现抗HBe，说明病毒复制减少，传染性弱但不是保护性抗体。 HBeAg的血清学转换是指HBeAg含量消失同时伴HBeAb出现，是目前临床上慢性乙肝治疗的近期目标最初目标是减少乙肝病毒的DNA复制。5、HBcAb乙肝病毒核心抗体是乙肝急性感染的早期标志，在血清中存在的时间长，包括IgM和IgG。抗HBc IgM是机体感染后最早在血液中出现的特异抗体
12、，是新近感染或病毒复制的标志。抗HBc-IgG在感染后逐步产生。高滴度的HBcAb存在常表示体内有HBV复制。HBcAb阳性时表示乙肝现症感染或既往感染。抗HBc不是保护性抗体，高滴度抗HBc-IgM是急性或近期感染的重要指标，在慢性肝炎活动期也可呈阳性，标志着乙肝病毒在复制，有传染性。抗HBc-IgG可持续存在数年至数十年，是既往感染的标志。大三阳：以上指标中的1、3、5为阳性；小三阳：以上指标中的1、4、5为阳性。6、HBcAb-IgM：是早期HBV感染的特异性血清标志。初次感染早期即上升，数月后无论HBsAg消失与否，HBcAb-IgM表达稳定，对于急性肝炎诊断很有价值。其效价降低常提示
13、预后较好。长期不降至正常范围者，提示有转化为慢性肝炎的可能。7、pre-S1：即乙肝病毒前S1抗原，作为病毒外膜蛋白成分存在于HBV Dane颗粒和管形颗粒上，在病毒感染、装配、复制和刺激机体产生免疫反响等方面有着十分重要的意义。前S1抗原与HBV-DNA、HBeAg检测率高度符合，是一项十分重要的病毒复制指标。前S1抗原可以随HBeAg消失而消失，与阴转时间正相关，可作为病毒去除与病毒转阴的指标。HBeAb阳性的慢性乙肝患者和HBV慢性无病症的携带者中，前S1抗原阳性可表示病毒的复制。该指标阳性的患者传播病毒的危险性明显高于阴性/无病症的携带者。前S1抗原阳性常提示急性乙肝向慢性乙肝的转变。
14、该指标阴转越早、疗程越短，预后也越好。8、pre-S2：即乙肝病毒前S2抗原，其上具有高免疫性的抗原决定簇和多聚蛋白受体，为人类T/B淋巴细胞的识别表位，pre-S2与HBV的感染和复制有密切的关系，对临床早期诊断，了解预后及制备乙肝高效疫苗有重要意义。前S2抗原与HBsAg阳性存在显著相关性。在急性乙肝中，前S2抗原与HBsAg都可作为HBV复制标志。在慢性乙肝中，前S2抗原的出现提示慢性肝炎进入活动期。该抗原长期存在，提示患者有转为慢性乙肝的可能。前S2抗原不仅能判断HBV的感染，而且对观测疾病预后、药物选择及疗效观察也有作用，是对乙肝两对半的有效补充。以上指标中的1、2、3、4、5、7、
15、8项，在临床上称为乙肝七项HbsAgHbsAbHbeAgHbeAbHbcAb临床意义+-+-潜伏期或急性乙肝早期+-+-+急性或慢性感染，以HbcAb-IgM鉴别；病毒复制活泼，传染性强大三阳+-+急性HBV感染趋于恢复；慢性乙肝携带者小三阳-+-+急性HBV感染恢复期，有免疫力-+-+乙肝恢复期，已有免疫力-+过去感染，但无法检出HbsAg；低水平慢性感染；无病症携带者-+-成功接种过乙肝疫苗，或以前感染过HBV，现已康复，有免疫力三丙型肝炎病毒感染 HCV的感染特点是慢性化几率高，感染过程长，存在不同程度的肝组织病变并呈进展性加重，局部患者可转变为肝硬化及肝癌。放射免疫诊断RIA和ELISA检测血清中HCV抗体是临床常用的检测方法。机体产生的HCV抗体不是中和抗体【即可与细菌毒素、病原体(如病毒)及其产物特异性结合并发挥中和作用的抗体。能中和毒素的毒性作用或阻断病毒感染靶细胞】，
