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1、叶绿体希尔(Hill)反应活力测定英国科学家罗伯特希尔(R. Hill, 1939)用光照射加有草酸高铁的叶绿 素悬浊液时，发现Fe3 +还原成Fe2 +并放02。因此把在光照条件下，绿色植物的 叶绿体裂解水，释放氧气并还原电子受体的反应称作希尔反应(Hill reaction)。 希尔反应的意义在于：证明了光合作用在叶绿体中进行；植物放出的氧是水在光 下被分解和氧化，这种水的光氧化反应与C02的还原可分开进行，因而划分出光 反应和暗反应两个阶段；发现了光反应中有光诱导的电子传递和水的光解及02 释放；发现了水在光反应中起到的是供氢体和电子供体的双重作用。叶绿体是植物进行光合作用的细胞器，依据
2、分离所得叶绿体的结构完整程度 大致将它分成两类：被膜破碎的叶绿体(类囊体)具有光合电子传递、光合放氧 和光合磷酸化的功能 被膜完整的叶绿体具有同化二氧化碳的完全的光合作用功 能。下面介绍类囊体的制备及其Hill反应活力测定。(一)实验原理用STN (Sucrose,Tricine或Tris,NaCI)提取并经分级离心的叶绿体碎片， 具有完整的类囊体，把其放入一定的反应介质中给予照光，能通过反应中心的电 子传递进行希尔反应、放氧和光合磷酸化。当用Fecy(Fe3+)作为电子受体时，它 接受电子还原为Fe2+,而Fe2+可与邻菲啰啉(OP)反应生成红色的络合物，510nm 下的OD与Fe2+的浓度
3、成正比，由此可测定希尔反应活力。FecyFe3+ ADP+32Pi Fe2+ AT32P+H20fir,NADP1Rly丿2Fe + AD 卩+Pi Fe2+ + AT 驻 P+HQNADFHlr门刚为(四)实验步骤1. 配制 STN 研磨液取 Tricine (或 Tris,0.2mol/L, pH 值 7.4) 10ml、Sucrose (1 mol/L) 40ml、 NaCl (0.1 mol/L) 10ml，定容到 100ml。2. 希尔反应活动测定(1) 将STN、研具、烧杯、离心管、纱布放入冰箱冰冻(约15分钟)。(2) 样品洗净后放入冰箱(4C8C) 15-20min。(3) 配
4、制反应液。使其最终浓度为：Tricine (或Tris,pH值8.0) 50mmol/L、 MgCl22mmol/L、Fecylmmol/L、Na2HP042mmol/L、ADP lmmol/L。配好反应液后分 装入指管，每只2ml。(4) 水浴调温。把玻璃缸的水温调至合适范围(菠菜、小麦、蚕豆20C，水稻 25C)，其内放入指管。(5) 叶绿体(类囊体)的提取。叶片去中脉剪碎加STN (约5-10ml/g) 迅速 研磨成颗粒状四层纱布过滤，离心4000r/min离心1 min2 min,沉淀悬浮(12mlSTN)离心1000r/minl min, 上层液于另一只试管，用STN稀释到约含叶 绿
5、素200g/ml，放入冰浴用于测定Hill反应活力和叶绿素含量。( 6)照光反应。调准缸内水温，每管加叶绿体提取物0.2ml,开灯照光1min,闭灯后立即加20%TCA 0.2ml以中止反应。以照光前加0.2ml 20%TCA的对应试管作对照。(7) Fe2+的测定。将上述试管以4000r/min离心2min，取二支试管，放入试管(用遮光试管架)中， 分别取离心后的上清液07ml，力口Na3C6H507溶液(0.2mol/L) 2ml、水1ml、FeCl3(0.01mol/L) 0.1ml、OP (0.05 mol/L) 0.2 ml，摇匀，置约25C下显色 15min, 在510nm下分别测定照光和对照的OD值，以用水代替上清液的为对照。(8) 叶绿素含量测定。取上述叶绿体提取物0.2ml加4.8ml 80%丙酮，摇匀，以4 000r/min离心1min2min， 在652下测OD值。按下列方程计算叶绿素含量：Chl(p g/ml)= od625xio X2534.5(五)结果计算：希尔反应活力二OD(光照对照)x 24 X 5000 x 60oDumol -1Fecyo.7 Chl (ug /ml )
