第六章 毛细管电泳仪* 绪言1、 概念：在极细的毛细管内所进行的各种形式的电泳，称为毛细管电泳(capillary electrophoresis， CE)2、 类型：有毛细管区带电泳，胶束电动力学毛细管色谱、毛细管筛分电泳、毛细管等电聚 焦电泳、毛细管等速电泳等3、 毛细管电泳特点：(1) 高效、快速、微量、可全部自动化⑵与高效液相色谱(HPLC)相比，毛细管电泳(CE)成本低，选择性大，且几乎不消耗溶剂3) 散热效率高，分离质量好4) 灵敏度和分辨率高，操作简便，污染小，应用范围广4、 历史发展：1967 年：最先在 3mm 直径毛细管中作自由溶液的区带电泳1974年：用200〜500Dm内径的毛细管作电泳分离1981年：用75Dm内径玻璃毛细管柱，加30kV电压实现电泳1 9 84年：引入了胶束毛细管电动力学色谱的方法 1987年：实现了毛细管等电聚焦及毛细管凝胶电泳1988年：首次利用CE作微量物质提取并把激光引入CE检测器，大大提高了检测灵敏度第一节 毛细管电泳的工作原理一、带电粒子的迁移(一)偶电层和Zeta势1、 偶电层：固体与液体接触时，若固体表面由于某种原因带一种电荷，则因静电引力会使其周围液 体带有相反电荷，即在液-固界面形成偶电层，两者之间存在电位差，叫Zeta势。
毛细管电泳中，带电粒子表面和毛细管壁表面都有偶电层2、 粒子的 Zeta 势：电解质中的任何带电粒子被异性电荷的离子所包围，部分异性离子被吸附到粒子上，部 分则游离在附近被吸附的“固定”离子有一个切平面，和带电粒子间的电势差，称为粒子 的 Zeta 势3、 管壁的偶电层和Zeta势：(1) 偶电层：毛细管一般为石英管，内表面为硅胶表面并带负电(pH>3)则管子中溶液的正 离子因受静电引力就会聚集紧贴在表面附近，从而形成偶电层2) Stern 层：偶电层中由于吸附而紧贴在表面的离子叫 Stern 层；其它可移动的游离离子为 扩散层，游离离子的电荷密度随与表面距离增大而急剧减小3) 管壁的Zeta势：Stem层和管壁表面间的电势差称为管壁的Zeta势偶电层的厚度□:管壁的 Zeta 势随与管壁表面距离增大而按指数规律衰减，使其衰减一个指数单位所需 的距离叫偶电层的厚度口二) 恒定场强下带电粒子的迁移1 、带电粒子移动速度 vep ：电泳时， vep 为ep epv =u E ep ep 式中卩为带电粒子的迁移率，E为场强ep2、 粒子的迁移率卩：在充满自由溶液的开口管中，卩为epep口比=昭/4冗耳□口式中□是流体的介电常量，□是介质的粘度。
Di是粒子的zeta电势3、 影响®的因素：(1) 表面电荷越大，©越大⑵如果电荷给定，贝I」质量越大，®越小3)对非胶体粒子，®近似正比于(Z/M)2/3M、Z分别是粒子的分子量和净电荷) (三) 电渗1、 概念：指高电场下由偶电层中水合阳离子或质子所引起的流体朝负极方向运动的现象 电渗现象中整体移动着的液体叫电渗流(electroosmotic flow，简称EOF)2、 电渗的迁移率：□卩=8^ /4冗耳口 eo w 其中Dgw为管壁的Zeta势 电渗流的速度：v =u E=8&wE/4冗耳eo eo 上式与电泳的迁移率和电泳移动速度类似3、影响电渗因素：管壁的Zeta势越大，偶电层越薄，介质粘度越小，电渗流速就越大通常电渗流速是电泳流速的5〜7倍4、带电粒子运动速度v和迁移率卩口 ：因毛细管内同时存在着电泳和电渗，不考虑它们的卩二卩 +卩ep eoL L~d ttU相互作用，贝v=v +v =(u +u )Eep eo ep eo式中Ld是毛细管从进样口到检测器的距离,tr是粒子通过该距离所用的时间,Lt是毛细管柱的全长, U 是电压， E=U/Lt5、 粒子移动特点：因电渗流从阳极流向阴极，所以正离子：运动方向和电渗一致，故它最先流出毛细管 中性粒子：其电泳速度为“零”，故它随电渗而移动。
负离子：运动方向和电渗相反，故当电渗流速大于电泳流速时，它在中性粒子之后流出毛细管 电渗流速小于电泳流速时，贝它将无法流出6、 控制电渗流的不同方法：(四) 梯度场强下带电粒子的迁移* 恒定场强下的毛细管电泳，某组分区带的移动速度：dx/dt=yE式中□为该组分在场强E下的迁移率，是指电渗和电泳两者移动速度的代数和 梯度场强下的毛细管电泳，因场强是时间的函数，即：E=E(t)故在一段时间内某一组分在管柱内移动的距离为：氏=Jt2応(t)dt t1二、影响谱带展宽的因素(一) 几个概念1、柱效和塔板高度因 CE 和色谱技术很相似，故电泳谱带展宽可直接沿用色谱的塔片高度和柱效的概念作为指 标理论塔扳数N：指虚拟的塔板的数量即把色谱柱近似看成精馏塔，以虚拟的塔板数的 多少来衡量分离效率的高低N 可从分离结果的色谱图直接计算，即：N=5.54(t /W)2式中t□称为保留时间，即流出曲线最高点所对应的时间；W 叫半峰宽，即峰高一半处的宽度单位塔板的高度：H=L/N 这里L是柱长2、流型： 电渗是流体相对于带电管壁的移动，即带电的外壳离子把电渗力传递进去使流体移动当电渗力与粘滞力平衡时，整个流体像一个塞子一样匀速前进，整个流型呈扁平型的塞子流 (谱带展宽很小)。
这是 CE 的理想状态直径小于200pm的毛细管中，这种流型不受管径的影响 在这种流型电泳中，反映柱效高低的塔板数为：N=vLd/2D=pELd/2D式中v和□为带电粒子的运动速度和迁移率，Ld 为进样口到检测器的距离，D 为溶质的扩散系数，E 为场强二) 影响谱带展宽的原因：有两类① 是来源于溶液和溶质本身，如自热、扩散和吸附② 是来源于系统，如进样和检测等1、 自热(1) 电解质溶液在高电场下会产生焦耳热，散热过程中，在毛细管内形成径向温度梯度(中 心温度高)，破坏了扁平塞子流型，导致谱带展宽2) 管径大，电阻小，电流大，产生焦耳热多，且不易散热3) 抑制焦耳热和温度梯度的方法：见下表2、 扩散和吸附(1) 扩散：是物质分子由高浓度区域自发迁移到低浓度区域的输运过程扩散会引起谱带的 展宽扩散系数D小的物质，展宽程度较小2) 吸附：溶质与毛细管壁间存在吸附与疏水作用，造成谱带展宽 吸附原因：① 是阳离子溶质和带负电管壁的离子相互作用② 是存在疏水相互作用 蛋白质、多肽带电荷数多，有较多的疏水基，吸附问题特别严重，是目前分离分析该类物质的一大难题 特点：细内径毛细管柱，有利于散热，但比表面积大(柱内表面积和体积之比)会使吸附 增加，引起组分谱带的展宽也越大，故须尽可能抑制。
第二节 毛细管电泳仪基本结构* 由高压电源、毛细管柱、检测器，两个缓冲液槽，及记录装置组成 记录装置可为记录仪、积分仪，或是有控制功能的计算机工作站CE 的分离过程是在毛细管内完成的，故毛细管是核心部件，下面就毛细管柱的尺寸、形状 和材料作介绍一、毛细管柱： 一般为圆管型应是化学和电惰性的，可透光，有一定柔性，易于弯曲1、材料：(1) 聚四氟乙烯：可透紫外光，电渗很弱缺点是管子内径不均，对样品有吸附，热传导差 等2) 玻璃：电渗最强，但有杂质3) 石英：最常用，分天然和人造两类，基本成分是二氧化硅2、内径：内径140Dm以下散热较好，目前使用的多在25〜75Dm0* 细管柱优点：(1)可减小电流，即减少自热2) 散热快，可保持电渗流流型的扁平性及分离的高效0 缺点：(1)不利于抑制吸附0(2)进样、检测和清洗困难03、长度：由塔板数公式N=DELd/2D知：(1) 场强恒定时，塔板数与柱长成正比0但柱长不能无限增加，因要使场强恒定，柱两端须 增加电压0(2) 电压恒定时，柱长增加，可减少自热0但会降低场强，增加分析时间0* 常用柱长约 30cm04、管壁厚度： 壁厚有两部分，包括石英本身和外面的涂层(热导率很低的聚酰亚胺)0通常有两种规格，厚壁的石英管外径375口 m,薄壁的外径150Dm。
一般厚壁管可改善 散热0二、检测器： 有紫外检测器、荧光检测器、质谱检测器、电化学检测器、拉曼光谱检测器等；前两种使用最广0(一)紫外检测器：1、 原理：入射紫外光通过样品时，被吸收的多少符合朗伯-比耳定律0检测点在靠近末端的管柱上，检测点管子的外涂层要烧掉02、 例子：如图为HPE-100型紫外检测器原理样品光6和参比光7相对比，可知样品吸 收了多少紫外光03、 三种紫外检测方法① 固定波长：光源为低紫外氘灯，用滤光片获固定波长的光② 可变波长：光源为氘灯或钨灯，用单色器(棱镜或光栅)获连续可调波长的光③ 快速扫描：有两类，其一用线性二极管阵列装置快速捕获紫外光，另一则利用硅光电倍增管作快速扫描二）荧光检测器1、原理：多原子分子吸收光子时，电子从基态跃迁到高能态，然后分子通过无辐射过程弛 豫到最低激发态，并在回到基态时发射出光子，称为荧光2、光源：激发用的辐射光为紫外光或激光因激光单色性好，故容易校准和减小光散射， 可大大提高检测灵敏度常用波长325nm的氦镉（He-Cd）激光光源3、 方法：检测也是在管柱上进行，管子的外涂层要除掉4、 应用：在DNA序列测定的CE中广泛使用但对不能发射天然荧光的化合物，须预先加 荧光剂。
三） 电化学检测器用来监测电泳毛细管中的流出物1、 原理：根据检测原理不同，分成电位检测器、电导检测器或安培（电流）检测器等2、 类型：CE中使用的电化学检测器有安培型和伏安型两种安培型较简单，使用较多四） 质谱检测器1、 原理：是将待测物分子转成带电粒子，再用恒定磁场使带电粒子按质量大小顺序分离， 形成有规则的质量谱2、 特点：对单一组分有很强的鉴别能力对复杂大分子混合物的分离极强3、 种类：有很多，其中电喷射离子质谱对蛋白质的鉴别特别有用五） 拉曼光谱检测器1、 原理：单色光照射被分析物质，通过拉曼技术可控制散射光，使其在返回它原来位置时 作全方位的重新发射入射光和散射光之间的频差，一般落在中红外区2、 光源：为40mW的He-Cd激光发生器在422nm处发射激光，在471.2nm处监控散射 光六） 间接检测：包括间接紫外、间接荧光、间接安培检测等 间接紫外检测：方法：缓冲液中加少量在紫外区有吸收的化合物，称为间接试剂，使之产生很高的本底当无紫外吸收的离子通过窗口时，从而产生一个负峰缺点：灵敏度比直接检测低1〜2个数量级七） 小结：各种不同的检测方法比较：三、进样因毛细管直径很小，故进样技术要求很高；现在很多CE仪器都配有自动进样装置。
进样时应满足两方面的要求：（1） 进样时不能引入显著的区带扩张；（2） 样品量必须很少，否则易造成过载下面介绍几种进样的原理和方法一) 电迁移进样也叫电动力学进样1、方法：毛细管的阳极端，在接触缓冲液前，先直接置于样品溶液，并在很短时间内加进 样电压，使样品通过电迁移进入毛细管这时的电迁移是电泳和电渗的综合结果进样量通过改变进样电压和时间进行控制2、特点：(1) 电迁移进样装置简单，不需附加设备。