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1、兔多抗制备方案一、材料（一） 动物：健康成年家兔，雄性，体重23公斤。（二） 器材：剪刀、镊子、注射器（2ml、50ml）附针头（16号、12号、9号）、称量瓶（10ml）、 量筒、动物固定架、灭菌三角烧瓶（200ml）、手术器械一套、血管夹、黑丝线、塑料放血管等。（三）试剂1. 灭菌生理盐水；2. 抗原：合成多肽（5mg）冻干粉；纯化蛋白5mg/ml；（冻干粉可以先加入1ml灭菌生理 盐水稀释成5mg/ml,使用时在取适量；也可以按实际情况使用，节约使用）3. 75%酒精；4. 弗氏完全佐剂（FCA） sigma产品；5. 弗氏不完全佐剂（FIA） sigma产品；二、免疫方法抗原剂量为1m
2、g/每只每次，具体方法如下：1. 用剪刀剪去家兔两后脚掌的部分兔毛，以75%酒精消毒皮肤；2. 第一次免疫：将1mg IgG抗原用生理盐水稀释至0.5ml，再加入等体积的弗氏完全佐 剂（即FCA 0.5ml），用2ml注射器充分混匀后于两只后足垫（即脚掌皮下）0.5ml；3. 第二次免疫：与第一次间隔10-14天，将1mg IgG抗原用生理盐水稀释至0.5ml，再 加入等体积的弗氏不完全佐剂（即FIA 0.5ml），用2ml注射器充分混匀后于背部皮下多点 注射，每点注射0.1ml；4. 第三次免疫：与第二次间隔10-14天，注射部位、剂量均同第二次；5. 与第三次免疫间隔5-7天后，从耳静脉采
3、血0.51.0ml，分离血清，以双相琼脂扩 散试验测定免疫血清的抗体效价（即试血）。效价至少应达到1 ： 16以上时才能放血。6. 若效价未达到要求，可用不加佐剂的抗原液（鼠IgG）耳静脉内注射免疫。即于1周内 注射3次，分别为0.1、0.3、0.5ml。间隔1周再试血。如效价达到要求应立即放血。三、放血（一）心脏采血法1. 家兔仰面，四肢缚于动物固定架上（或由助手抓住四肢固定）；2. 剪去左胸部兔毛，消毒皮肤；3. 用左姆指摸到胸骨剑突处，食指及中指放在右胸处轻轻向左推心脏，并使心脏固定于左 胸侧位置。然后，以左拇指触摸心脏搏动最强的部位（一般在第三和第四肋骨之间）；4. 用50ml注射器（
4、连接16号针头），倾针45角度，对准心搏最强处刺入心脏抽血；5. 将抽取的血液立即注入无菌三角烧瓶中，待凝固后分离血清。（二）颈动脉放血法1. 家兔仰卧同上固定。头部略放低以暴露颈部。剃毛及消毒皮肤；2. 沿颈部中线切开皮肤约10cm，分离皮下组织，直至暴露出气管两侧的胸锁乳突肌；3. 分离胸锁乳突肌与气管间的颈三角区疏松组织，暴露出颈总动脉后使之游离；4. 于动脉下套入两根黑丝线，分别置于远心及近心端。结扎远心端的丝线。近心端的动脉 用血管夹夹住；5. 用尖头小剪刀在两根丝线间的动脉璧上剪一小口，插入塑料放血管。再将近心端的丝线 结扎固定于放血管上，以防放血管滑脱；5.松开血管夹，使血液流入
5、灭菌三角烧瓶中。一般一只家兔可放血80100ml。四、分离血清将三角烧瓶的血置37r温箱1小时，再置4C冰箱内34小时。待血液凝固血块收缩后， 用毛细滴管吸取血清。于3000rpm离心15分钟，取上清加入防腐剂（0.01 %硫柳汞或0.02%叠氮 钠，最终浓度），分装后置4C冰箱中保存备用。抗体的具体效价目前可以不用ELIAS做，直接用琼脂双向扩散实验在免疫三次后测下效价 是否达到要求即可。弗氏体即弗氏佐剂是目前动物实验中最常用的佐剂，分为不完全弗氏佐剂和完全弗氏佐剂。不完全弗氏佐剂是液体石蜡与羊毛脂混合而成，组分比为15： 1,可根据需要而定，通常为2： 1。不完全佐剂中加卡介苗（最终浓度为
6、220mg/ml）或死的结核分枝杆菌，即为完全弗氏佐剂 （FCA）。乳化方法：（1）研磨法：先将佐剂加热并取适量放入无菌的玻璃研钵内，待冷却后再缓缓 滴入等体积的抗原溶液，边滴边按同一方向研磨，滴加抗原的速度要慢。待抗原全部加入后，继 续研磨一段时间，使之成为乳白色粘稠的油包水乳剂。本法适于制备大量的佐剂抗原，缺点是研 钵壁上粘附大量乳剂，抗原损失较大。（2）注射器混合法：将等量的弗氏佐剂和抗原溶液分别 吸入两个注射器内，两注射器之间以一细胶管相连，注意排净空气，然后交替推动针管，直至形 成粘稠的乳剂为止。本法优点是容易做到无菌操作，抗原损失少，适用于制备少量的抗原乳剂。 但同时难以乳化完全，
7、个别抗原，用塑料注射器根本推不动，而用玻璃注射器又有渗漏。制备好 的乳化剂经鉴定才能适用。鉴定方法是将乳化剂滴入冷水中，若保持完整不分散，成滴状浮于水 面，即乳化完全，为合格的油包水剂。（3）超声：实验室条件好点的，比如说有超声破碎仪的， 一定要控制超声频率和时间，超声容易激发一些自由基，对抗原有未知损害。乳化方法要根据抗 原和需要而定。琼脂双扩散试验一、原理在溶液中的可溶性多价抗原与血清抗体相遇，当两者的比例适当时可以形成一种网状的不溶 性的大分子复合物，发生免疫沉淀反应。当这样的抗原和相应的抗体在含有电解质的琼脂凝胶中 相对扩散时，在抗原与抗体的比例适当处会形成可见的沉淀线。利用这种反应检
8、测抗原抗体反应 的实验技术叫免疫双扩散实验，是免疫沉淀反应的一种。免疫双扩散常用于动物免疫效果的检测 和血清抗体效价的测定。沉淀线的特征与位置不仅取决于抗原抗体的特异性及相互间浓度比例， 而且与其分子大小及扩散速度相关。当抗原抗体存在多种系统时，可呈现多条沉淀线以至交叉反 应。二、实验材料1 .抗原：用0.01M PBS (pH7.2)或生理盐水稀释成lmg/mL人IgG ；2 .抗血清：兔抗人IgG血清；3 .实验试剂:0.01M PBS (pH7.2), 1%琼脂糖;4 .实验用具：11cm培养皿，200|iL微量可调加样器及吸头，1.5mL无菌尖底离心管，打 孔器。三、操作步骤1. 1%
9、琼脂糖配制：称取琼脂糖隹，加入0.01M PBS (pH7.2) 100mL，微波炉中小功率 加热，使琼脂完全溶化。2. 倒平板：取干净11cm培养皿3个平放于实验台(台面要水平)，将融化的1%琼脂糖 趁热倒培养皿中(约加15mL)，使琼脂糖厚度达3mm，在室温下放置使琼脂糖冷却凝固。3. 打孔：将琼脂糖平板放在画好的打孔式样的样板上，用自制打孔器(内径3-5毫米) 在琼脂上照样板打孔，打出两组呈梅花状排列的小孔。用针头小心地将打好的孔中的琼脂挑出， 当心不要碰伤了孔周围的琼脂。图双向琼狷扩散实验打孔示意图图2双向琼脂扩散实验结果示意图4. 抗原稀释：取1.5mL无菌尖底离心管6支排列于离心管
10、架上并做好标记，在每管各加入生理盐水50|iL,吸取1:10稀释的l mg/mL IgG 50pL加入第1管中并充分混匀；自第1管中吸出50pL 加入第2管中，经充分混匀后吸出50pL加入第3管中，如此依次2x稀释至第6管，混匀后 吸出50pL弃去。此时1-6管所含人IgG的稀释度为1:2、1:4、1:8、1:16、1:32、1:64。5 .抗血清稀释：取1.5mL无菌尖底离心管8支排列于离心管架上并做好标记，在每管各加入生理盐水50pL，吸取鼠抗或兔抗人IgG血清50pL加入第1管中并充分混匀；自第1管中吸出50pL 加入第2管中，经充分混匀后吸出50pL加入第3管中，如此依次2x稀释至第6
11、管，混匀后 吸出50pL弃去。此时1-6管所含免疫血清的稀释度为1:2、1:4、1:8、1:16、1:32、1:64。6 .加样：在每组呈梅花状排列的小孔的中央孔中加一滴稀释抗原约30pL的免疫血清，周围孔加不同 稀释度抗血清。加样时将每孔加满即可，注意不要使溢出孔外。7 .孵育盖上培养皿盖放37r温箱中过夜。8.结果观察将培养皿从塑料盒中取出，在散射光的背景下（培养皿后方约15cm处用手或深色物挡住） 观察，或在凝胶成像系统上用白光光源观察抗体孔与适当稀释的抗原孔之间的白色沉淀线，有沉 淀线为阳性，否则阴性。ELISA测定兔、鼠抗血清效价（这个目前可以不用做）近几十年来免疫学分析方法迅猛发展
12、，特别是在使用抗原和抗体标记分析技术后，检测敏感 性和特异性比原来许多经典的免疫学分析方法得到极大提高。上世纪50年代建立免疫荧光技术 （IFA），60年代放射免疫分析技术（RIA）出现，在70年代初期又建立了酶标记抗原或抗 体的分析技术。由于酶的高效生物催化作用，一个酶分子在数分钟内可以催化几十、几百个底物 分子发生反应，产生了放大作用，使得原来极其微乎其微的抗原或抗体在数分钟后就可被识别出 来，这种技术被称为酶联免疫吸附试验法（Enzyme-Linked Immuno-Sorbent Assay，ELISA）， 本法自70年代初期由VA N Wee men和Schuars，Enagvall
13、和Perlmarn等相继分别报道后，现 已引起广泛重视。ELISA的基础是抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记。结合在固相载 体表面的抗原或抗体仍保持其免疫学活性，酶标记的抗原或抗体既保留其免疫学活性，又保留酶 的活性。在测定时，受检标本（测定其中的抗体或抗原）与固相载体表面的抗原或抗体起反应。 用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与液体中的其他物质分开。再加入酶标记的抗 原或抗体，也通过反应而结合在固相载体上。此时固相上的酶量与标本中受检物质的量呈一定的 比例。加入酶反应的底物后，底物被酶催化成为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接 相关，故可根据呈色的深浅进行定性或定量分析
14、。由于酶的催化效率很高，间接地放大了免疫反 应的结果，使测定方法达到很高的敏感度。图1间接EL1SA示意图二、实验材料1 .抗原：用 0.01M PBS (pH7.2)稀释成 l mg/mL IgG ；2 .抗血清：兔抗人IgG血清；3 .实验试剂：0.01M PBS (pH7.2) , 0.01M 碳酸盐缓冲液(1.59 g NaCO3 , 2.93 g NaHCO3, 力口 ddH2O 至 1000 mL ) , 0.01M PBST (pH7.2，含 0.05 % Tween-20), 1%BSA, HRP-羊抗 鼠 IgG , HRP-羊抗兔 IgG , TMB/H2O2 底物液，2M
15、 H2 SO4 ；4 .实验用具：96孔酶标板，200pL微量可调加样器及吸头，5mL无菌试管，洗板机，酶 标仪。三、操作步骤1. 抗原稀释：取5mL无菌试管8支排列于离心管架上并做好标记，在每管各加入0.01M碳酸缓冲液 (pH9.6)2.34mL，吸取260|iL l mg/mL人IgG加入第1管中并充分混匀；自第1管中吸出1.3mL加 入第2管中，经充分混匀后吸出1.3mL加入第3管中，如此依次2x稀释至第8管，混匀后吸 出 1.3mL 弃去。此时 1-8 管抗原的稀释度为 1:20、1:40、1:80、1:160、1:320、1:640、1:1024、 1:2048。2. 抗血清稀释：
16、取5mL无菌试管12支排列于离心管架上并做好标记，在每管各加入0.01M PBS (pH7.2)， 0.9mL，吸取1:50稀释的鼠抗或兔抗人IgG血清0.9mL加入第1管中并充分混匀；自第1管 中吸出0.9mL加入第2管中，经充分混匀后吸出0.9mL加入第3管中，如此依次2x稀释至第 12管，混匀后吸出0.9mL弃去。此时1-12管所含免疫血清的稀释度为1:100、1:200、1:400、 1:800、1:1600 、1:3200 、1:6400 、1:12800、1:51200、1:102400 、1:204800 、1:409600 。在96孔酶标板A行各孔加入1:20稀释的人IgG 100|iL , B-H行各孔
