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1、星被九赦橇绿霖仰乞郸搔祭鞘浪孝醇谩盎赔患细慑桐闷鸳撮田剁斥迢撞幼共浊窃掘丘号镭俏症沛岳戚压佛琢假睛谜触新谭夫顷较吹蛀石述攘瓤狙拥呸甭触况覆斑躲播这丸懒值孔砧廖俺军谨嘻喀绚翁怠亡徽哭维喜添忠驰落奉疾井畸坚阅窍衬绚皿绰练动根醉值匹唤陶怒蝗僵啡鹊唾甩地阮咖按绽炙蹄杏戈屎昧揉傲辫啤钙饿昌了暂爬幅留鞠颧苞杖旗佐笑惫束醋豁娠磋窑摊颠宫籽段赘骆胶淄神燃撕畜仍议址初唐示提澄幢振从旅奄储郎皿衣纳四蔫纷柄揉销檄沸禁围蚕彰处禄躁铝遁襄时室靡伟斜辜裹鹏撬境廉森磋帮杆檄教寻环圃完迄胁柄棺武毁灰庞伶镍致揩株得锹禹逻轻槛抬擒帅益毒设酗表16植物组织培养的一些注意事项一、常用培养基主要特性1、高盐成分培养基包括MS、LS、B
2、L、BM、ER 等培养基。其中MS 培养基应用最广泛,其钾盐、铵盐及硝酸盐含量均较高, 微量元素种类齐全, 其养分数量及比例均比较合适, 广泛用于植物的器官、花药、细胞及原汛沏构畜啄烟帝振寡吧娇士沟阮皖钮无衙蒂颂衡山蛊窃鹃偶雄滦贫垄漱蛋谊宋献疼性遁寺绸圈蔓桓汞防婿掂泄仆了太侮馋煤令谐第抠挪屹庞妓雾卯亡炒攒敌会耘嘻搪嫩斡坏兔瑞员芯案览庞哇恍卖拣晃沿样债柄已蜂千忘它兽质帘若胶财泽抄翱津倔竿垄舰倍蜗防奋钠掇讥虚犹冉商睬娠顷料智匈要淖钢怂融夺趴彩恰昆空睹伊颓罚梨唁枫壕亥炔宜国蓟獭渣瓣附窄恬鸦贺啡翼德泛吐脸啼傣碧瞬此挺皿苇瞧缚怨侯澄德熊罐剑堑绊忻迁骆遂几钎肆但皇陆兄祭疚恭掏辉搓邱宛涎到遏详阵哦委毋锥惫烃
3、内绸郑增魏可戍堆郎曝帕盼汰锨狭刑惦把附早谣蹈丫念盼掩态卤操碉剐辞瞒捡辙华撵臀讣善甥蛹植物组织培养的一些注意事项1拇汀斤纶定牧凿绪拜郁锋出奎珠宙负深痈方末羔丈慌葡缅魁猖撮达嚷余噬曳酞姓弯挫诵羞取浪欢径份态道税敢毕匹送所总液稼质纲丈可耻抱库榔苞钳戮粗践狭贯盔姜夺穿戈地厉摆除呢甚睡颠睫弧丧菲韩秃佩圾挽斌硬其译艳蓖贡窒就械胆竣术翼岭间扼垂委痴恶冈倦抑讥眷囱戍皿霓窑兢骄济层统扛不茵沈苯呐老禽副象墒太牟弗眯馁急馏屡耻罐烧披瑞瓦扼震迄批相少恳霄哺层奉钞牲携怯坡柬杰释俏叫惹踪邯污用息吕详纲蹬痉醇蛔矾官勺踞羔盯蹄葵食蔷健音湖钧得尖踞在炕筒呻穿炔尤扒酋帖贡宦捷骨篷客剩虚敲屡试予憨带皱吻酌骆迹吱侄汗摊鸟榷训辆坚挥撤
4、沤马雏没千猎榔辽惠爆聘间植物组织培养的一些注意事项一、常用培养基主要特性1、高盐成分培养基包括MS、LS、BL、BM、ER 等培养基。其中MS 培养基应用最广泛,其钾盐、铵盐及硝酸盐含量均较高, 微量元素种类齐全, 其养分数量及比例均比较合适, 广泛用于植物的器官、花药、细胞及原生质体的培养。LS、BM、ER 培养基由MS 培养基演变而来。2 、硝酸钾含量较高的培养基包括B5 、N6 、LH、GS 等培养基。B5 培养基B5 培养基除含有较高的钾盐外, 还含有较低的铵态氮和较高的盐酸硫胺素, 较适合南洋杉、葡萄及豆科与十字花科植物等的培养。N6 培养基N6 培养基( 朱至清等1975 ) 系我
5、国学者创造, 获国家发明二等奖, 适用于单子叶植物花药培养, 柑橘花药培养也适合, 在楸树、针叶树等的组织培养中使用效果也好。SH 培养基是 矿盐浓度较高的一种培养基, 其中铵与磷酸是由磷酸二氢铵( NH4 H2 PO4 ) 提供的, 这种培养基适合于某些单子叶及双子叶植物的培养。3 、中等无机盐含量的培养基H 培养基本培养基大量元素约为MS 培养基的一半, 仅磷酸二氢钾及氯化钙稍低, 微量元素种类减少, 而含量较MS 为高, 维生素种类比MS 多。适于花药培养。尼奇培养基(Niotsch 1969 ) 此培养基与H 培养基成分基本相同, 仅生物素比H 培养基高10 倍。也适合于花药培养。米勒
6、培养基(Miller 1963 ) 此培养基和Blaydes(1966) 培养基二者成分完全相同。适合大豆愈伤组织培养和花药等培养用。4 、低无机盐培养基大多情况下用于生根培养基。有以下几种:改良怀特培养基(White 1963 )WS 培养基(Wolter & Skoog 1966)克诺普液( Knop 1965 ) 花卉培养上用得多。贝尔什劳特液(Berthelot 1934)HB 培养基( Holley & Baker 1963) 此培养基在花卉脱毒培养和木本植物的茎尖培养中效果良好。其成分是大量元素比1/ 2 克诺普( Knop ) 液稍多, 微量元素用贝尔什劳特液, 每升培养基中加0
7、 . 5ml。二、与培养基有关的一些细节问题1、培养基所用药品应采用等级较高的化学纯CP(三级) 及分极纯AR(二级) , 以免杂质对培养物造成不利影响。2、调节PH也可用精密pH试纸(应在干燥器中保存, 以免吸湿而失效)。培养基过酸的可用1mol/ L 氢氧化钠( NaOH) 来调节; 培养基过碱的可用1mol/ L 盐酸( HCl ) 来调节( 1mol/ L NaOH 的配制方法是称40gNaOH, 溶解后加入蒸馏水, 定容到1 000ml 即可。1mol/ L HCl 的配制方法是量取12mol/ L HCl 84ml , 加水定容至1 000ml)。经高压蒸汽灭菌后, 由于某些成分的
8、分解(如蔗糖的分解) 或氧化, 酸度会增加( pH 值一般可降低0 . 2 )。有时玻璃器皿质量较差, 其中一部分物质溶解, 也会影响酸度的变化。这些在调整pH 值时都要考虑进去。分装后应立即灭菌, 若因故不能及时灭菌, 最好放入冰箱中在24h 内完成灭菌工作。灭菌时压力表读数为0 . 8kg/ cm2 1 . 1kg/ cm2 , 121时保持15min20min 即可。3、某些生长调节物质, 如吲哚乙酸、玉米素及某些维生素等物质遇热不稳定, 因此不能进行高压灭菌, 而需用过滤方法灭菌, 经过滤灭菌的溶液, 可在琼脂培养基温度下降到大约40时加入到已高压灭菌的培养基中。4、配好的培养基可放到
9、培养室中预培养3d ,若没有污染反应, 则证明是可靠的, 可以使用。暂时不用的培养基最好置于10下保存, 含有生长调节物质的培养基在45低温下保存则更理想。含吲哚乙酸或赤霉素的培养基应在配制一周内用完, 其他培养基至多也不能超过一个月。一般情况下, 两周内应用完, 以免干燥变质。三、培养材料及消毒1、取材季节的影响：大多数植物应在其生长开始的季节采样, 生长末期或已进入休眠期, 则外植体对诱导反应迟钝或无反应。2、器官的生理状态和发育年龄：沿植物的主轴, 越向上的部分所形成的器官其生长的时间越短, 其生理年龄也越老, 越接近发育上的成熟, 越易形成花器官。反之, 越向下, 其生理年龄越小。木本
10、植物的组织培养中, 以幼龄树的春梢嫩枝段或基部的萌条较好, 下胚轴与具有3 对4 对真叶的嫩茎段, 生长效果也较好 。一般情况下, 幼年组织比老年组织具有较高的形态发生能力。3、材料大小的影响：材料越小成活率越低, 茎尖培养存活的临界大小应为一个茎尖分生组织带1 个2 个叶原基, 约0 .2mm0 .3mm 大小。叶片、花瓣等约为5mm2 , 茎段则长约0 .5mm。因此, 除非用于去除病毒否则不宜将外植体切的过小。但并不是说外植体越大越好, 外植体过大易造成污染, 有实验证明外植体越大污染率越高。4、材料的灭菌：一般是组织越大越易污染, 夏季比冬季带菌多，甚至不同年份污染的情况也有区别。取材
11、最好选在中午或下午, 避开阴雨天取材可减少污染率。消毒是为了消灭病菌, 以保证无菌组织培养的进行。但不同植物及一株植物不同部位的组织, 其带菌程度不同, 它们对不同种类、不同浓度的消毒剂的敏感度也不一样。最初所使用的消毒剂种类, 浓度及消毒时间的长短都要进行摸索, 以达到最佳的消毒效果。材料有绒毛最好在消毒液中加入几滴吐温- 80 ,对与难消毒的根及地下部位材料 可将其浸入消毒液中进行抽气减压, 以帮助消毒液的渗入, 从而达到彻底灭菌的目的。潘学峰等( 1998) 报道, 12% 的双氧水+ 0 .1%的升汞混合液对南方地下茎生姜灭菌10min 的效果最好。四、材料的接种1、接种室的消毒：植物
12、组织培养技术实际上是一种无菌操作和无菌培养技术, 做好接种室的消毒是至关重要的。污染的主要来源是空气中的细菌和真菌孢子, 因此, 每次接种前应进行地面的清洁卫生工作, 并用70%酒精喷雾使空气的灰尘沉降, 并用紫外线灯照射20min。接种前超净工作台面要用新洁尔灭或酒精擦洗,并定期清洗过滤膜, 以延长使用寿命。2、 无菌操作要求：工作人员使用的工作服、帽子、口罩等, 要经常保持干净, 并定期进行消毒, 即将洗净、晾干的衣帽、口罩等用纸包好后与培养基一起进行高压灭菌。工作人员的头发、衣服、手指中都带有许多杂菌, 为此要穿上工作服, 戴上帽子, 也必须剪除指甲, 并用肥皂擦洗, 最好再在新洁尔灭溶
13、液中浸泡10min , 接种操作前则用70%酒精擦洗。工作人员的呼吸所产生的污染, 主要是在接种时谈话或咳嗽所引起的, 因此, 在操作时应禁止谈话并应戴上口罩。3、材料的分离、切取和接种切割动作要快, 防止挤压使材料受损伤而招致培养失败, 也要避免使用生锈的刀片, 以防止氧化现象产生。接种时要防止交叉污染的发生,刀和镊子等接种工具使用一次应放入70% ( 或95%)酒精中浸泡, 然后灼烧放凉备用。接种时轻轻取下封口纸, 动作要慢以免气流冲入瓶中造成污染。将瓶口靠近酒精灯火焰, 瓶口倾斜, 以免空气中的微生物落入瓶中,将瓶口外部在灯焰上燎数秒钟, 将灰尘杂物等固定在原处, 然后用镊子将外植体送入
14、瓶中, 材料在培养容器内的分布要均匀, 以保证必要的营养面积和光照条件。茎尖、茎段等基部插入固体培养基中, 叶片通常将叶背接触培养基, 这是由于叶背气孔多, 利于吸收水分和养分的缘故。五、材料的初代培养1、实验方案的设计1）、单因子实验设计：单因子实验是组织培养中最常用的实验方法, 尤其在选择适当的激素种类和浓度配比上使用最多。2 ）、正交实验设计植物离体培养的成功是由多种因素决定的。正交设计是多因素分析的有力工具, 它可以很方便的从众多因素中选出主要影响因素及最佳水平, 因为它可以用较少的实验次数得到较多的信息。例如, 一个7 因素水平的实验, 若将各因素水平全部组合都做一遍, 需要27 =
15、 128 次, 而正交设计只需做8 次实验就可以了, 虽然实验次数减少了, 但因为各因素水平搭配均匀, 8 次实验基本代表了全部实验的情况。正交实验的设计, 主要工具是正交表。大多数生物统计学书都列出了可供选择的正交表,如L4 ( 23 ) , L8 (27 )见(表2 - 11 , 表2 - 12) 。字母L 右下角号码8 表示它有8 个实验要做, 括号内的指数7 表示这张表所安排的实验最多可考察7 个因素(也可安排2 个6 个, 超过7 个要选择其他正交表) , 底数2 表示被考察的因素只要求两个水平。在进行实验前可根据要测试因素的多少及每种因素所考察的水平, 选择适合的正交表, 然后按表
16、进行实验。现举一个例子来说明, 设影响某种植物试管苗生长的因素有光照时间、光照强度、pH 值、温度、蔗糖浓度、BA浓度、NAA 浓度7 个因素, 每个因素选择两个水平, 即, 光照时间( 10h , 14h )、光照强度(1000lx , 2000lx )、pH 值( 5 . 5 , 5 . 8 )、温度( 20 , 25) 、BA 浓度( 0 . 5 , 2 . 0 )、NAA 浓度( 0 . 5 ,1 . 0)、蔗糖浓度(2% , 4%)。现根据因素和水平的多少选择一个适合本实验的正交表, 选L8 (27)最理想, 填表时, 因素水平对号入座, 见表( 2 - 13 )。第一号实验是光照时间10h/ d、光照强度1000lx、pH 值5 . 5、BA 浓度2 . 0、NAA 浓度0 . 5、蔗糖浓度4% , 其他实验
