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1、总RNA的提取（Trizol法提取）在收集到生物材料之后，最好能即刻进行RNA制备工作。若需暂时储存，则应以液氮将生物材料急速冷冻后，储存于-80冷冻柜。在制备RNA时，将储存于冷冻柜的材料取出，立即以加入液氮研磨的方式打破细胞，不可以先行解冻，以避免RNase的作用。1. 提取组织RNA时，每50100mg组织用1ml Trizol试剂对组织进行裂解；提取细胞RNA时，先离心沉淀细胞，每5-10 106个细胞加1ml Trizol后，反复用枪吹打或剧烈振荡以裂解细胞；2. 将上述组织或细胞的Trizol裂解液转入EP管中,在室温1530C下放置5分钟；3. 在上述EP管中，按照每1ml TR
2、IZOL加0.2ml氯仿的量加入氯仿，盖上EP管盖子，在手中用力震荡15秒，在室温下（1530）放置23分钟后，12000g（28）离心15分钟；4. 取上层水相置于新EP管中,按照每1ml TRIZOL加0.5ml异丙醇的量加入异丙醇，在室温下（1530）放置10分钟,12000g（28）离心10分钟；5. 弃上清，按照每1ml TRIZOL加1ml 75%乙醇进行洗涤，涡旋混合，7500g（28）离心5分钟，弃上清；6. 让沉淀的RNA在室温下自然干燥；7. 用Rnase-free water 溶解RNA沉淀。 PCR 实验室常用DNA聚合酶有三种：TaKaRa TaqTM，TaKaRa
3、EXTaqTM和PyrobestTM DNA Polymerase。TaKaRa TaqTM是一般的DNA聚合酶，保真性较差，但价钱便宜，一般用于基因表达的检测等。TaKaRa EXTaqTM是具有Proof reading活性的耐热性DNA聚合酶，具有一定的保真性，而且其扩增得到的PCR产物3端附有一个“A”碱基，如果希望直接将产物克隆到T-vector可以用此酶。PyrobestTM DNA Polymerase也是具有Proof reading活性的耐热性DNA聚合酶，其特点是保真性极高，扩增得到的PCR产物为平滑末端。如果进行基因的扩增请使用此酶。1. 按下列组成在PCR反应管中调制反
4、应液：TaKaRa TaqTM或TaKaRa EXTaqTM的配方ReagentQuantity, for 50l of reaction mixture10X PCR buffer （Mg2+ free）5 lMgCl2（25mM）如TaKaRa TaqTM加3 l 如TaKaRa EXTaqTM加4 l2.5mM dNTP mix4 l 10M Primer 上游1 l10M Primer下游1 lTemplate DNA1 lTaq或EXTaqDNA Polymerase0.25 lSterile deionized waterUp to 50lTotal50 l /SamplePyro
5、bestTM DNA Polymerase的配方ReagentQuantity, for 50l of reaction mixture10X Pyrobest buffer 5l2.5mM dNTP mix4l 10M Primer上游1l10M Primer 下游1lTemplate DNA1lPyrobestTM DNA Polymerase0.25lSterile deionized waterUp to 50lTotal50l /Sample 反应总体积根据实际情况进行调控，可以做2050l以节约试剂； 将上表各成分加入到0.2ml或0.5ml灭菌的PCR薄壁管中； 如果不用PCR仪
6、的加热盖，在反应混合液的上层加30 50l 的矿物油防止样品在PCR的过程中蒸发；2. 按以下程序进行PCR扩增。PCR反应条件视模板、引物等的结构条件不同而各异，在实际操作中需根据具体的情况以及PCR结果而进行优化。StepTemperature, C Time, minNumber of cyclesNote起始变性94951-3（5）1变性94950.5-225-35退火温度比理论退火温度大概低5C，再根据反应结果优化退火37-700.5-2延伸70-75根据扩增产物的大小（1.5）每分钟延伸1000bp最终延伸70-75101保存4反应结束后，抽取扩增样品5l，用琼脂糖凝胶电泳分析扩增
7、结果，用DNA marker判断扩增片段的大小或冷冻保存，以备以后分析使用。RT-PCRProtocol: TaKaRa One Step RNA PCR Kit (AMV) 1. 按下列组成在PCR反应管中调制反应液ReagentQuantity, for 50lof reaction mixture10One Step RNA PCR Buffer5l25 mM MgCl210l10 mM dNTP mix5lRNase Inhibitor (40 U/l)1lAMV-Optimized Taq1lAMV RTase XL (5 U/l)1l上游特异Primer (20 M)1l下游特异P
8、rimer (20 M)1l实验样品RNA（1 g Total RNA）1lRNase Free dH2O24lTotal50l /Sample1. 反应总体积根据实际情况进行调控，可以做2050l以节约试剂；2. 将上表各成分加入到0.2ml或0.5ml灭菌的PCR薄壁管中；3. 如果不用PCR仪的加热盖，在反应混合液的上层加30 50l 的矿物油防止样品在PCR的过程中蒸发；2 按以下条件进行反应StepTemperature, CTime, minNumber of cyclesNote逆转录50301逆转录酶失活9421变性940.525-35退火37-650.5退火温度比理论退火温度
9、大概低5C，再根据反应结果优化延伸72根据扩增产物的大小Taq酶每分钟延伸1000bp最终延伸72101反应结束后，抽取扩增样品5l，用琼脂糖凝胶电泳分析扩增结果，用DNA marker判断扩增片段的大小或冷冻保存，以备以后分析使用。琼脂糖核酸电泳1. 用蒸馏水将制胶模具和梳子冲洗干净，放在制胶平板上，封闭模具边缘，架好梳子；2. 根据欲分离DNA片段大小用凝胶缓冲液配制适宜浓度的琼脂糖凝胶：准确称量琼脂糖干粉，加入到配胶用（专物专用）的三角烧瓶内，定量加入电泳缓冲液（一般2030 ml）；3. （称重）放入到微波炉内加热熔化（补水至原重）。冷却片刻（琼脂糖凝胶凝点为56左右），加入一滴荧光染
10、料，轻轻旋转以充分混匀凝胶溶液，倒入电泳槽中，待其凝固；4. 室温下3045分钟后凝胶完全凝结，小心拔出梳子，将凝胶安放在电泳槽内；5. 向电泳槽中倒入电泳缓冲液，其量以没过胶面1mm为宜，如样品孔内有气泡，应设法除去；6. 在DNA样品中加入10体积的载样缓冲液（loading buffer），混匀后（反复吹打，移液枪枪头始终保持在液面下），用枪将样品混合液缓慢加入被浸没的凝胶加样孔内（可用手扶住枪头 ）；7. 接通电源，红色为正极，黑色为负极，切记DNA样品由负极往正极泳动 (靠近加样孔的一端为负)。一般60100V电压，电泳2040min即可；8. 根据指示剂泳动的位置，判断是否终止电泳
11、（对于以分离获取大基因片段如质粒，MARKER可适宜跑出胶外）；9. 电泳完毕，关上电源，在凝胶成像仪上观察电泳带及其位置，并与核酸分子量标准Marker比较被扩增产物的大小。 琼脂糖凝胶浓度与线形DNA的最佳分辨范围琼脂糖凝胶浓度线形DNA的最佳分辨范围（bp）0.5%1,00030,0000.7%80012,0001.0%50010,0001.2%4007,0001.5%2003,0002.0%502,000胶回收纯化DNA（1、胶回收后跑电泳没有条带，最可能的原因：起始上样量不足（我们一般至少要100ulPCR产物）；胶回收试剂盒存在质量问题，等等。2、胶回收没有条带，可能产物浓度较低，
12、这种情况下进行连接转化，是可以得到阳性菌落的。但是，你要自己能保证前期试验没有任何问题。3、TAKARA有个核酸共沉剂，如果PCR只有单一条带，可以用它进行纯化，回收率很高。）1. 琼脂糖电泳，将特异电泳带用刀切下放入到EP管中，称琼脂糖带的重量；2. 按照每100mg加400l的量加入binding buffer，放入到EP管振荡器中，4555温育振荡，直到所有的琼脂糖都溶解（大概要5分钟）；3. 取出纯化柱，将上述溶解液转移至柱中，室温下放置2分钟，8,000rpm 离心1分钟，弃EP管中的液体，将纯化柱放回EP管中；4. 加500l的wash buffer至柱中，8,000rpm 离心1
13、分钟。弃管中的溶液；5. 重复操作4步的操作1次，最后将纯化柱放入EP管中10,000rpm离心30秒，除去痕量的wash buffer；6. 将纯化柱放入一个新的EP管。加3040l H2O或者elution buffer至纯化柱膜的中央，在37或50下放置2分钟，10,000rpm离心1分钟洗脱DNA，将EP管中的DNA溶液放在-20保存。7. 注：若想要不电泳而直接纯化DNA溶液，只需要在第2步中按100l液量加400l的binding buffer,其余的步骤不变。大肠杆菌质粒DNA的提取（碱裂解法）此方法适用于小量质粒DNA的提取（在提取土壤中微生物基因组时，考虑到大片段，采用蛋白酶
14、K与20%SDS裂解菌体）提取的质粒DNA可直接用于酶切PCR扩增。1. 取1.5ml细菌培养物于EP管中，4000rpm离心1分钟，弃上清液，使细菌沉淀尽量干燥（再次离心，完全去除培养基上清）；2. 将细菌沉淀重悬于用冰预冷的100 l溶液I (50 mmol/L葡萄糖，10 mmol/L EDTA pH 8.0，25 mmol/L Tris-HCl pH 8.0) 中，剧烈振荡（这一步至关重要，确保菌体重悬）；3. 加入200 l新配制的溶液II(0.2 mol/L NaOH，1SDS（m/v）)，盖紧EP管口，快速颠倒离心管5次，以混合混合物，确保离心管的整个内表面与溶液II接触，不要涡旋（强调柔和，静置2min为佳），置于冰浴中；4. 加入150 l预冷溶液III(每100 ml 的溶液III中含60 ml 5 mol/L 乙酸钾，11.5 ml冰乙酸，28.5 ml H2O)，盖紧EP管口，反复颠倒数次（时间短，不剧烈震荡，当基因组片段大小断裂为50100bp时，无法PDS共沉淀），使溶液III在粘稠的细菌裂解物中分散均匀，之后将管置于冰上35分钟；5. 在最大转速（12000g）下离心5min，取上清液（转移时悬空滴加可以有效防止枪头上的杂质进入）于另一新EP管（勿贪多，取到白色絮状杂质沉淀）
