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1、天花粉蛋白的融合表达与抗肿瘤效果的探讨摘要天花粉蛋白（Trichosanthin, TCS）是从中药植物栝楼块根中提取的一种 I 型核糖体失活蛋白，具有抗 HIV 感染、抗肿瘤等多种生物学活性。天花粉蛋白对黑色素瘤细胞、绒毛膜癌细胞等具有一定毒性，但由于缺乏对成纤维细胞、肝癌细胞等多种肿瘤细胞的敏感性，限制了在抗肿瘤方面的应用。细胞穿膜肽（Cell penetrating peptides, CPPs）是一类富含碱性氨基酸的短肽，具有介导蛋白质等生物活性分子高效进入细胞的能力。本研究就一种人源性穿膜肽 HBP 与重组天花粉蛋白融合表达，以此介导TCS 高效进入肿瘤细胞内发挥其药理效应等进行探索
2、。首先将TCS与 HBP 在原核表达系统中融合表达，经镍柱亲和层析进行样品纯化，纯化的样品经 MTT、激光共聚焦显微镜观察、流式细胞术等实验方法进行分析，考察其穿膜效果及体外诱导细胞凋亡能力、凋亡途径的研究。结果显示，细化一下，表明融合蛋白TCS-HBP相对于TCS而言具有更为显著的体外抑制Hela、B16、MCF-7肿瘤细胞生长能力，且具有更广的细胞谱。Western Blot 实验结果cleaved-caspase-3 表达水平存在显著上调，而Bcl-2 表达水平存在显著下调，与细胞凋亡线粒体途径中各个效应物理论表达水平的调整趋势完全吻合，推测 TCS-HBP 可能通过线粒体途径诱导 He
3、la 细胞凋亡。本研究以穿膜肽与抗肿瘤蛋白药物融合表达的穿膜策略为导向，选择人源性穿膜肽与抗肿瘤药物天花粉蛋白融合表达，通过对其穿膜效果的考察及体外诱导细胞凋亡能力、凋亡途径的研究，为抗肿瘤药物 TCS 运输及活性提高提供了一种新的策略。 关键词：天花粉蛋白，穿膜肽，凋亡，药物运输质粒构建鉴定，表达蛋白分子量等信息 AbstractTrichosanthin (Trichosanthin, TCS) is a type I ribosome extracted from Chinese medicinal plants of Trichosanthes in root tuber of ina
4、ctivating protein with multiple anti HIV infection and anti-tumor biological activity. TCS has certain effect on melanoma cells, choriocarcinoma cells, but due to the lack of sensitivity of fiber cells, hepatoma cells and other tumor cells, limiting antineoplastic applications. Cell penetrating pept
5、ides (CPPs) is a class of short peptide rich in basic amino acids, which has the ability to mediate proteins and other bioactive molecules to enter cells efficiently. The study of a human derived cell penetrating peptide HBP and recombinant trichosanthin fusion expression mediated by TCS, in order t
6、o enter tumor cells to explore the effect of the medicine etc.Firstly, TCS and HBP in prokaryotic expression fusion expression system, the sample was purified by nickel affinity chromatography, purified samples by MTT, laser confocal microscopy, flow cytometry and other experimental methods to analy
7、ze, study the cell apoptosis ability, induces apoptosis through the membrane effect and in vitro study. The results showed that the fusion protein TCS-HBP had a more significant inhibitory effect on the growth ability of Hela, B16 and MCF-7 tumor cells in vitro than TCS, and had a wider cell profile
8、. Western Blot results the expression level of cleaved-caspase-3 was significantly up-regulated, and the expression level of Bcl-2 was significantly reduced, adjusted trend level fully consistent with the theoretical effects of various mitochondrial apoptosis pathway in the expression of TCS-HBP pro
9、bably through the mitochondrial pathway induced apoptosis in Hela cells. In this study, cell penetrating peptides and anti tumor drug protein expressed in membrane fusion strategy as a guide, select the human transmembrane peptides and proteins by anticancer drugs and in vitro fusion expression, thr
10、ough the study on the effect of membrane induced cell apoptosis, apoptosis pathway, provides a new strategy for TCS transport and improve activity of anticancer drugs.Keywords：Trichosanthin, Cell-penetrating peptides, Apoptosis, Drug delivery目 录二级标题即可摘要IAbstractII目录III图表目录IV缩略词表V1 引言11.1 天花粉蛋白11.1.1
11、 天花粉蛋白的结构与功能11.1.2 降低天花粉蛋白的免疫原性并延长其胞内半衰期11.1.3 天花粉蛋白通过受体介导的内吞途径进入细胞21.1.4 天花粉蛋白诱导肿瘤细胞凋亡的可能途径31.2 细胞穿膜肽41.2.1 细胞穿膜肽的分类与性质51.2.2 细胞穿膜肽的穿膜过程及其机制51.2.3 细胞穿膜肽的应用与局限71.2.4 人源性穿膜肽 HBP71.3 研究目的和意义71.4 研究内容81.5 研究目标82 实验内容92.1 材料92.1.1 菌株及生物试剂92.1.2 大肠杆菌培养基92.1.3 细胞实验耗材102.1.4 常用缓冲液配制102.1.5 仪器与设备112.2 方法122
12、.2.1 质粒构建122.2.2 蛋白表达与纯化142.2.3 细胞实验153 结果与分析193.1 重组质粒的构建193.2 融合蛋白的表达与纯化203.2.1 重组蛋白 TCS 的表达与纯化203.2.2 融合蛋白 TCS-HBP 的表达与纯化213.3 融合蛋白体外抑制细胞活性分析MTT 实验223.4 融合蛋白穿膜能力分析233.5 融合蛋白特征生物学活性检测243.5.1 N-糖苷酶活性检测243.5.2 拓扑异构酶活性检测253.6 融合蛋白细胞凋亡与坏死检测253.7 融合蛋白流式凋亡检测273.8 融合蛋白诱导凋亡途径分析293.8.1 流式细胞术分析凋亡途径293.8.1 W
13、estern Blot 分析凋亡途径304 讨论与结论314.1 重组质粒的构建与融合蛋白的表达及纯化314.2 重组蛋白体外抑制细胞活性分析MTT 实验314.3 融合蛋白穿膜能力分析324.4 融合蛋白特征生物学活性检测324.5 融合蛋白细胞凋亡与坏死检测334.6 融合蛋白流式凋亡检测334.7 融合蛋白诱导凋亡途径分析33参考文献34致谢37图表目录插图目录图 1-1 TCS诱导JAR细胞凋亡3图 1-2 TCS诱导肿瘤细胞凋亡途径汇总4图 1-3 细胞穿膜肽依据平均净电荷及分类的分布图5图 1-4 细胞穿膜肽细胞摄入及胞内运输模式图6图 3-1 重组质粒的构建19图 3-2 重组蛋
14、白TCS纯化分析20图 3-3 融合蛋白TCS-HBP纯化分析21图 3-4 MTT分析目标蛋白对癌细胞及正常细胞的体外细胞毒性22图 3-5 TCS与TCS-HBP穿膜效果检测23图 3-6 TCS与TCS-HBPN-糖苷酶活性检测23图 3-7 TCS与TCS-HBP 拓扑异构酶活性检测24图 3-8 Hoechst/ PI双染检测细胞坏死25图 3-9 Annexin V-FITC/PI双染检测细胞凋亡27图 3-11 TCS-HBP细胞凋亡抑制检测28图 3-12 TCS-HBP诱导细胞凋亡效应物检测29图 3-9 Annexin V-FITC/PI双染检测细胞凋亡27图 3-9 An
15、nexin V-FITC/PI双染检测细胞凋亡27表格目录表 1.1 小鼠中 TCS及其衍生物的平均滞留时间与IgE浓度2表 1.2 TCS及其衍生物处理的几内亚猪剧烈过敏反应2表 2.1 菌种9表 2.2 限制性核酸内切酶9表 2.3 其他生物试剂9表 2.4 大肠杆菌培养基组分9表 2.5 大肠杆菌 IB 培养基配方9表 2.6 细胞10表 2.7 抗体10表 2.8 试剂耗材10表 2.9 缓冲液10表 2.10 13.5 % SDS-PAGE 电泳胶配方11表 2.11 仪器与设备11表 2.12 兔网织红细胞裂解系统反应体系16表 3.1 Hoechst / PI 双染检测细胞坏死24表 3.2 Annexin V-FITC / PI 双染检测细胞凋亡26表3.3 Annexin V-FITC / PI 双染检测细胞凋亡率27表 3.4
