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1、1 pBait-AbAi载体的构建（酵母报道子的构建）注：酵母报道子（pBait-AbAi）包含目的顺式作用元件的一个或多个拷贝， 且插入到pAbAi载体AbAir报告基因的上游。大量研究表明最有效的构建应包含 目的DNA三个以上的首尾连接的拷贝。首尾连接的拷贝产生方式很多，但对于 长度小于20 bp的调控元件，人工合成寡核苷酸是最方便可靠的途径。（1）设计并合成包含目的序列的两条反向平行的寡核苷酸序列，且两端加上与 pAbAi载体酶切产物一致的粘性末端（建议合成一个目的序列的突变序列 作为对照，以排除可能的假阳性）。（2）用TE buffer溶解寡核苷酸至终浓度100 pmol/L。（3）将
2、正向链和反向链按照1:1的比例混合（退火后的双链寡核苷酸最大浓度 为 50 pmol/L）。（4）95 OC保温30 s，去除二级结构。（5） 72 C 保温 2 min，37 C 保温 2 min，25 C 保温 2min。注：缓慢退火，有助于双链寡核苷酸的形成。（6）冰上放置。退火后的产物可贮存在-20 C冰箱备用。（7）酶切1 rL pAbAi载体，用凝胶回收纯化或柱纯化的方式纯化酶切产物。 注：回收前，可用琼脂糖凝胶检测是否酶切完全。（8） 将退火后的寡核苷酸稀释100倍至终浓度为0.5 pmol/L。(9)在连接反应管中加入如下成分：pAbAi 载体(50 ng/L)1.0 rLan
3、nealed oligonucleotide (0.5 Rmol/L)1.0 rL10XT4 DNA ligase buffer1.5 rLBSA (10 mg/mL)0.5 rLNuclease-free H2O10.5 rLT4 DNA ligase (400 U/rL)0.5 rL总体积15 rL注：如果有必要，可用1 rL nuclease-free H2O代替寡核苷酸作为阴性对 照。（10）将反应体系室温放置连接3 h，转化E coli，采用常规方法检测阳性克隆。注：可用酶切或测序进行检测。2质粒转化酵母细胞，生成Bait-Reporter酵母菌株（图）图3 Bait-Reporte
4、r酵母菌株生成原理示意图（1）用 BstB I 或者 Bbs I 酶切 2 rL pBait-AbAi，pMutant-AbAi，p53-AbAi 质粒， 使其在URA3基因处断开，纯化酶切产物。（2）按 Matchmaker Yeast Transformation System 2 的步骤用 1 r1 酶切后的质粒 转化YIHGold酵母。（3）稀释每个转化体系至1/10、1/100、1/1000，分别取每个稀释物均匀涂于 SD/-Ura琼脂平板上。3 d后挑取5个单克隆，用Matchmaker Insert Check PCR Mix1进行PCR检测阳性克隆，用Y1HGold的单克隆做阴
5、性对照。（4）在 PCR 管中加 25 r1 PCR-grade H2O。（5）用干净的枪头轻轻接触酵母单克隆，以获得非常少量的酵母细胞。将枪头 伸进PCR-grade H2O中搅拌，使酵母细胞散开。注：切忌挑取整个酵母单克隆，因为细胞过多会阻止PCR反应的进行。 如果加入细胞后水变浑浊，证明加入了过多的酵母细胞。（6）向每个管中加入 25 r1 Matchmaker Insert Check PCR Mix，混匀，离心。每个PCR管中现已含有如下反应物:25 pl25 pl50 plMatchmaker Insert Check PCR MixH2O/yeast总体积（7）按下述程序进行PC
6、R反应；95 C1 min98 C10 s55 C30 s 30 cycles68 C2 min（8）取5 pl PCR产物，用1%的琼脂糖凝胶电泳分析。注：引物与AbA基因以及URA3下游的Y1HGold基因组结合，扩增片段长约 1.4 kb。图4 PCR检测pBait-AbAi的插入情况正确的PCR检测结果应是：阳性对照：1.4 kb阴性对照：无条带诱饵菌株：1.35 kb+insert size（9）分别挑取PCR检测呈阳性的诱饵克隆和p53-AbAi对照克隆，在SD/-Ura 平板上划线培养。30 C孵育3 d后，将平板置于4 C保存，即为新构建 的 Y1HGoldBait/AbAi菌
7、株和p53/AbAi对照菌株。（10）经过长期放置后，挑取单克隆在YPDA液体培养基中过夜培养，离心收 集菌体，用1 mL预冷培养基（100 ml灭菌的YPDA与50 ml灭菌的75% 甘油混合）重悬菌体，速冻后与-70 C保存。3检测诱饵菌株AbAr基因的表达在不存在捕获物的情况下，由于克隆到pAbAi载体中的诱饵序列不同，诱 饵菌株报告基因的本底表达水平也不相同。例如：p53-AbAi对照的最低aureobasidin A 抑制浓度为 100 ng/ml。注：酵母单杂交实验成功的前提是没有内源转录因子能够与目的序列结合或 者结合能力非常弱。因此在进行文库筛选之前，检测所构建的诱饵菌株AbA
8、r基 因的表达情况十分重要。所以需要进行实验以确定进行文库筛选时抑制诱饵菌株 报告基因本底表达所需的AbA浓度。（1）分别挑取诱饵克隆和对照克隆，用0.9% NaCl重悬细胞，调节A600到0.002（大约2000个细胞/100皿）。（2）在下述培养基上分别涂布100皿重悬后的菌液，30 C培养2-3 d。SD/-UraSD/-Ura with AbA （ 100 ng/mL）SD/-Ura with AbA （ 150 ng/mL）SD/-Ura with AbA （ 200 ng/mL）预期结果如下所示：表1 AbAr基因预期本底表达结果AbA/（ng/mL）Y1HGoldp53-AbAi
9、克隆数Y1HGoldpBait-AbAi克隆数0约 2000约 20001000Bait dependent1500Bait dependent2000Bait dependent（3）在进行文库筛选时，使用AbA的浓度应为最低抑制浓度，或使用比最低 抑制浓度稍高的AbA浓度（高约50-100 ng/mL），以彻底抑制诱饵菌株的 生长。注：如果200 ng/mL AbA不能抑制本底表达，可以尝试提高AbA浓度至 500-1000 ng/mL。然而，在不存在捕获物的情况下，如果1000 ng/mL的AbA浓度仍无法抑制AbAr基因的表达，那么很可能存在能够识别并与目的序列结合的 内源调控因子，因
10、而该目的序列无法用来进行酵母单杂交筛选。4文库cDNA的合成提取试材总RNA，进行反转录合成cDNA。合成的cDNA末端具有与 pGADT7-Rec相同的酶切位点。(1) cDNA第一链的合成准备高质量的poly A和/或总RNA，用human placenta poly A+RNA作为阳性 对照。注：RNA的质量决定文库的质量，RNA应为所要研究的特定时期和特定组 织的RNA。在微量离心管中加入如下反应物：RNA 模板（0.025-1.0 pg poly A 和/或 0.10-2.0 pg 总 RNA）1-2 plCDS III（oligo-dT）or CDS III/6（random）引物
11、1.0 plDeionized H2O （使总体积达到 4.0 pl）1-2 pl总体积4.0 pl在另外一支管中加入对照cDNA反应物，即RNA使用1 pl (1 pg)control poly A+RNA。 72 C孵育2 min。 冰上放置2 min，轻轻混匀，立即加入步骤中的试剂。 每一个反应加入如下试剂，轻轻混匀离心。5 X first-strand buffer2.0 plDTT (100 mmol/L)1.0 plSMART M-MLV RTdNTP mixture (10 mmol/L)1.0 pl1.0 pl总体积5.0 pl注：步骤中的试剂可在步骤之前加好置于冰上。此步是c
12、DNA合成的 起始关键步骤，变性后的RNA/引物mix冰上放置的时间不应超过2 min。 如果用的是CDS III/6随机引物，25-30 C保温10 min。如果用的是CDS III 引物，省略此步，进行步骤。 42 C 保温 10 min。 加入1 pl SMART III oligo，充分混合，42 C保温1 h。 75 C保温10 min终止第一链的合成。 降至室温，加入1 pl RNase H（2 U）。11 37 C 保温 20 min。12 cDNA第一链合成产物应于-20 C保存，可用3个月。（2）long distance PCR （LD-PCR）合成 cDNA 第二链根据合
13、成cDNA第一链时使用的RNA量，下表给出了进行LD-PCR时最佳 的热循环数。使用的热循环数越少，非特异性PCR产物越少。表2 RNA量与最佳热循环数总 RNA/pgPoly A+RNA/pg循环数1.0-2.00.5-1.015-200.5-1.00.25-0.520-220.25-0.50.125-0.2522-240.05-0.250.025-0.12524-26LD-PCR反应混合物中加入如下物质(每个样品做2个100 pl体系，对照做1个100 pl体系)：First-strand cDNA (from protocol A)2 plDeionized H?O70 pl10X ad
14、vantage 2 PCR buffer10 pl50XdNTP mix2 pl5RACE 引物2 pl3RACE 引物2 plMelting solution10 pl50X advantage 2 polymerase mix2 pl总体积100 pl按照以下程序进行PCR反应：1个循环95 OC 30 sX 个循环95 oc 10 s -|68 oc 6 min I取7 pl PCR产物用1.2%的琼脂糖凝胶检测，检测时使用1 kb DNA ladder。(2) 使用 CHROMA SPIN+TE-400 柱纯化 ds cDNA为每一个要纯化的cDNA样品准备一个CHROMA SPIN+
15、TE-400柱。将纯化柱翻转几次，充分悬浮gel matrix o移去柱的顶盖和底盖，将柱放入2 ml收集管中。将柱放入离心机，700 g离心5 min以消除平衡缓冲液，弃掉收集管中的液体。将柱放入新的收集管中，把cDNA加到gel matrix的中央，切勿使样品沿柱的 内壁流下。注：加到边上易使样品沿柱内壁流下，易混有小片段cDNA。(6)700 g离心5 min，纯化的cDNA收集到管中。将两个纯化的cDNA样品合并到一管，测量体积。加入1/10体积3 mol/L醋酸钠(pH5.3)，混匀。加入2.5倍体积无水乙醇。(10) -20 C 冰冻 1 h。(11) 室温，14000 r/min 离心 20 min。(12) 小心弃去上清液，切勿碰到沉淀。(13) 14000 r/min瞬时离心，去除残留上清液。(
