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1、17B-雌二醇通过上调CXCR表达促进骨髓间充质干细胞的趋化迁移孙欣慰，杨铧琦，徐惠成（40038重庆，第三军医大学西南医院妇产科）【摘要】目的研究17p-雌二醇（17B-E2,17B-estradiol）对体外骨髓间充质干细胞（BMSCsBoneMesenchymalStemCells）趋化因子受体CXCR4表达的影响及CXCR4表达变化对BMSC趋化迁移的调控情况。方法全骨髓法+贴壁法分离、培养BMSCs不同浓度（1O-10、10-9、10-8、10-7、5X10-7,10-6mol/L）的17B-雌二醇诱导经雌激素受体拮抗剂ICI182780处理和未经处理的BMSCs后于不同时相点（24
2、、48h）,用RT-PCR法和Westernblot法分别检测细胞趋化因子受体CXCR4的表达情况，利用transwell小室体外迁移体系观察10-7mol/L17B-雌二醇诱导前后的BMSC对于不同浓度基质细胞衍生因子SDF-1的定向迁移情况，及采用AMD3100阻断SDF-1特异性受体CXCR4W对雌激素诱导前后BMSC定向迁移的影响。结果BMSC在不同浓度17B-雌二醇诱导24、48h后，其CXCR4mRN的表达均有不同程度的升高，其中以24h时10-7mol/L组升高最为明显。CXCR4蛋白表达在24h组以升高为主，24h时5X10-7mol/L组升高最为明显，48h组以降低为主。雌激
3、素受体拮抗剂ICI182780能够明显抑制17B-雌二醇对CXCR4表达的影响（PV0.05）BMSCs对SDF-1的定向迁移有明显的浓度依赖性，且相同条件下17B-雌二醇诱导后的BMSCs迁移细胞数显著高于未经诱导的BMSCs而CXCR4阻断剂AMD3100可明显抑制17B-雌二醇干预前后BMSC啲趋化迁移（PV0.05）结论17B-雌二醇在一定的诱导时间内可提高BMSCsCXCR4的表达，进而增强SDF-1对BMSC的体外趋化作用。【关键词】雌激素；骨髓间充质干细胞；SDF-1/CXCR4迁移【中图法分类号】【文献标志码】A17B-estradiolpromotethechemotaxis
4、migrationofbonemesenchymalstemcellbyup-regulatingCXCR4expressionSunXinwei，YangHuaqi，XuHuicheng（DepartmentofObstetricsandGynecology，SouthwestHospital，ThirdMilitaryMedicalUniversity，Chongqing，400038，China）【Abstract】ObjectiveToinvestigatetheeffectof17B-estradiolonregulatingdirectionalmigrationofbonemes
5、enchymalstemcellsinvitro.MethdsRatbonemesenchymalstemcellswereisolatedandculturedbyusingwholebonemarrowadherencemethod.TheBMSCsweretreatedwithestrogenreceptorantagonistICI182780and-10-9-8-7-7-6thenwereinducedwithvirousconcentration（10，10，10，10，5X10，10mol/L）of17B-estradiolfor24hand48h.Real-timePCRand
6、WesternblotmethodwereusedtodetecttheexpressionlevelsofCXCR4mRNAandproteinin17-Bestradiol-treatedanduntreatedBMSCs.Usingtranswellinvitro，weobservedthemigrationofBMSCsbefore-7andafterbeingtreatedwith10mol/Lof17-eBstradiol，whichinducedbydifferentconcentrationofSDF-1.ThentheeffectofCXCR4antagonistonthed
7、irectionalmigrationof17B-estradiol-treatedanduntreatedBMSCswasinvestigated。ResultsTreatedwithvirousconcentrationof17-estradioBlfor24hand48h，theexpressionlevelsof-7BMSCsCXCR4mRNAincreasedtovaryingdegrees.Thepeakappearedwhentheconcentrationwas10-7mol/L.TheCXCR4proteinincreasedinthe24hgroup，inwhichthep
8、eakwaswith17B-estradiolof5X10mol/L.In48hgroup，CXCR4proteinmostlyreduced.TheestrogenreceptorantagonistICI182780caninhibittheeffectof17B-estradiolonexpressionofCXCR4（PV0.05）.TheBMSCsmigrationinducedbySDF-1dependedontheconcentrationofSDF-1andinthesameconditions，thenumberofmigratedcellsinthe17-estradBio
9、l-treatedgroupwassignificantlylargerthanthenumberoftheuntreatedgroup.TheCXCR4blockerAMD3100caninhibitthechemotaxismigrationofBMSCsbeforeandafterinducedby17B-estradiol（PV0.05）.Conclusion17B-estradiolcanpromotetheexpressionlevelsofCXCR4inBMSCswithinacertaintime，thuspromotethedirectionalmigrationofBMSC
10、sinvitro.【Keywords】Estrogen；Bonemesenchymalstemcells;SDF-1/CXCR4；MigrationSupportedbytheGeneralProgramoftheNationalNaturalScienceFoudationofChina（81170533）.Correspondingauthor:XuHuicheng，E-mail:基金项目国家自然科学基金面上项目（81170533）通信作者徐惠成，E-mail:骨髓间充质干细胞（BMSCsBoneMesenchymalStemCells）是一类具有多向分化潜能的干细胞，有易于分离、培养和扩
11、增的特点，因此被认为是组织工程重要的种子细胞。干细胞进行移植后在体内向靶组织的定向迁移情况，直接关系着干细胞移植的治疗效果，因而一直是组织工程领域备受关注的问题。作为趋化因子家族的成员，基质细胞衍生因子SDF-1及其受体CXCR4在干细胞迁移归巢、增殖等过程中都发挥重要作用（1,2）。有研究表明，雌激素可以上调靶细胞CXCR4的表达（3,4），从而可促进细胞的迁移（5）o本实验拟就不同浓度雌激素诱导BMSCs后CXCR表达的情况进行研究，并在此基础上利用transwell小室体外迁移体系观察雌激素诱导前后的BMSCs向不同浓度SDF-1趋化、迁移的情况，从而为雌激素用于干细胞移植的相关治疗提供
12、理论依据。1材料和方法1.1实验动物健康SD大鼠购于第三军医大学大坪医院野战外科研究所实验动物中心，3周龄，体质量约100g，雌性，清洁级。1.2主要试剂DMEM-F12胰蛋白酶，青、链霉素（Hyclone公司），胎牛血清（FBS（Gibco公司），FITCanti-ratCD44，FITCanti-ratCD45,FITCanti-ratCD31,PEanti-ratCD29，PEanti-ratCD166（eBioscience公司），17-B雌二醇，CXCR4体拮抗剂AMD3100（Sigma公司），大鼠SDF-1，ER拮抗剂ICI182780（R&D公司），兔抗大鼠CXCR航体（Abc
13、am公司），transwell（美国millipore公司），Trizol,DNAMaker2000，Taq酶（北京天根），CXCR4和B-actin内参由上海生工合成。1.3引物根据GenBank上所查基因的mRNA序列，采用GeneTool设计弓I物，CXCR上游序列：5-GCGCAAGGCCCTCAAGACTAC-3CXCR4下游序列：5-GGCGTAGAGGATGGGGTTCAG啥ctin上游序列：5-ACCCCGTGCTGCTGACCGAG-3-actin下游序歹心5-TCCCGGCCAGCCAGGTCCA-31.4实验方法1.4.1大鼠BMSCs勺分离、培养与鉴定取3周龄SD大鼠颈
14、椎脱臼法处死，75%酒精浸泡5min。无菌条件下取双侧胫骨、股骨，仔细剔除表面肌肉，PBS冲洗23遍。剪去干骺端，暴露骨髓腔，注射器抽取含10%FBS勺DMEM-F12Z复冲洗骨髓腔，收集全部冲洗液，1500r/min离心5min，弃去上清液，加入适量含10%FBS勺DMEM-F12充分吹打成单细胞悬液，接种至含10%FBS勺DMEM-F12t养基中，于5%CQ,37C、饱和湿度的培养箱中培养。24h后首次换液，以后每23天换液1次。当观察到细胞铺满瓶底80%寸，按1:3进行传代。当细胞传至第3代时，0.25%胰蛋白酶消化、收集细胞于EP管内，PBS洗涤3次，弃去部分上清，EP管内仅余100卩
15、L液体，按说明书加入FITC标记的兔抗大鼠CD44CD45抗体和PE标记的兔抗大鼠CD31CD29CD166抗体，避光室温孵育30min，PBS洗涤3次，上流式细胞仪测定细胞表面CD44CD45CD31CD29CD166的表达情况。RT-PCR法测定BMSCsCXCR4勺表达以106个/孔的细胞量接种第2代BMSCs至6孔细胞培养板，10%FBS的DMEM-F12培养至细胞铺满60%70%寸弃去培养基，进行雌激素干预实验。实验设置2个实验组，每个实验组包括6个E2干预孔和6个对应的E2拮抗孔，每组分别以未经处理的BMSCs作为阴性对照，E2干预组各孔分别加入不同浓度（10-10、10-9、10
16、-8、10-7、5X10-7、10-6mol/L）的17-B雌二醇，E2拮抗组各孔细胞先用10-8mol/L雌激素受体拮抗剂ICI182780封闭1h，再按照E2干预组方法向各孔加入上述6个浓度的17-B雌二-6醇和10mol/LICI182780。2个实验组的药物干预时间分别为24h和48h。药物干预完成后弃去培养基并用PBS洗涤。收集BMSC于1.5mLEP管中，加入1mLTrizol，按照Trizol说明书提取总RNART-PCR制备cDNA,反应总体积20此，RNA模板量2卩goPCF反应：取CDNA2.0卩L,反应体积20.0订，向0.2mLPCR管内加入CXCR4I物0.5卩L或B-actin引物0.5卩L，峠07.0卩L，2XMixTaq10卩L,扩增条件：94C5min94C30s57C30s72C30s）X30cycles72C10mino实时荧光定量：应用SYBRGreenI荧光染料技术行实时
