心肌细胞培养方法详述

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1、心肌细胞培养方法详述配液：Hanks液、低糖DMEM液、高糖DMEM液、胰酶消化液、双抗液、碳 酸氢钠液、盐酸液。取鼠：鼠盆用棉铺好，取鼠。 准备：事先检查显微镜、磁力搅拌器及离心机是否好用，提前三小时把小牛血 清、胰酶、抗生素拿出来化开。其余未冻药品也提前 20 分钟拿出来缓和一下。 新洁尔灭（0.1%）泡纱布（用10ml5%的新洁尔灭加水至500ml即得），消毒 地面（1： 500 的 84 液）。用酒精棉球擦拭台面后把物品摆放好，开紫外线灯照 30 分钟后开鼓风机 吹至实验结束。物品：白大衣、饭盒小剪子、小镊子（ 4 套）（一套剪皮肤、一套开胸取心，一套剔除心缘纤 维组织，一套剪碎心脏）

2、瓶皿（2 套） 两个小圆培养皿，培养皿内加 DMEM 液，先后装取出的心 和剔出纤维组织后的心 一个小烧杯装碘酒和酒精棉球250ml 烧杯 3 个一个用于水浴，事先加好水，最好是一或二蒸 一个装0.1%新洁尔灭 150ml 左右，消毒小鼠500ml 烧杯 1 个，用作废液缸。50ml 烧杯 3 个（剪碎心肌组织，最后配液）三角烧杯（ 50ml） +小转子（小转子，酒精擦，双蒸水冲后，再把酒精彻 底冲掉后用三角烧杯高压）离心管及帽（12-14 个），两个试管吸管 （58 个）大镊子 （两把，持物，例夹棉球等）台面：磁力搅拌器、纱布（事先用于托盘装 0.1%新洁尔灭浸泡）、试管架、泡 沫塑料板、五

3、个针头（不用消毒） 75%酒精棉球及碘酒（消毒棉球，泡酒精、 碘酒）大镊子两把（一把夹棉球，一把取鼠）、 3 个 250ml 烧瓶（一个装一蒸 水，一个装新洁尔灭，另一为空的备用） 1 个 500ml 烧瓶（废液缸）、温度 计、 PH 试纸（事先调 PH 值）、酒精灯、打火机/火柴、载玻片（5-10 个） 用 于培养前看接种密度及消化后看细胞密度、注射器 5ml 6 个（胰酶、 DMEM、 小牛血清） 1ml 2 个（双抗液） 20ml 备用 2 个、微量加样器 1000ml 及 500ml 以上物品均用紫外线照 30 分钟。另外准备手套、帽子、口罩、 24 孔培养板、离心机 +一把小锁、未冻

4、药品及 DMEM、HCL、NaHCO3、小牛血清。事先把显微镜、离心机、磁力搅拌器电源插好。检查酒精灯是否有酒精， 碘酒和酒精棉球是否够用。先把物品递入，后穿大衣、帽子和口罩。然后把酒 精灯打开，把瓶皿摆好，再用一个瓶皿装酒精棉球。培养过程：1. 把两个 5ml 注射器分别插入 DMEM 和胰酶中，分别向两个圆皿中加入 5ml 的 DMEM 培养液。用一把大镊子从鼠盆里取出一只生后 23 天的 SD 大 鼠，放入 0.1%新洁尔灭浸泡一下后拿出放在泡沫板上，用针头把鼠固定（位置 摆正），用另一把大镊子取碘酒棉球擦皮肤，再用酒精棉球脱碘，取一把小剪 子及小镊子开皮，充分撕拉开，再用酒精棉球消毒，

5、后换另一把小剪子和镊子 在剑突处正中线稍偏左开胸取心。2. 取出的心放在刚才准备的一个装有 DMEM 的圆皿中再取下一只。重复以 上过程。（鼠全部杀死后，把取鼠镊及泡沫板、新洁尔灭缸等拿出台面。消 毒、清洁，铺纱布、换手套。3用第三副剪子和镊子把圆皿中的心脏周边的血凝及纤维组织剔除掉，放 在另一个预先装好 DMEM 的圆皿中。抽取 5ml 的胰酶，然后将其中少许放入 50ml 的小烧杯中，大部分倒入三角烧瓶中。用第四副剪子将烧杯中的心脏剪成 1mm3 的碎块，倒入三角烧瓶中（可用剪刀刮入），再用剩余胰酶刷净烧杯。4把温度计和三角烧杯放入 250ml 烧瓶中，（事先调好水量，多会没过三 角烧杯，

6、少温度会不均匀）。打开磁力搅拌器电源，调温度（使 -缓慢加到 3435C ）和转速（转速不可过快，否则会打碎细胞，基本上标志为平行）。一 定要注意监控。5温度达到34C时开始计时，第一次为10分钟，以后可为8分钟，事情 况而定。在此期间，在试管架上摆上 5、6 个离心管，标上 1、1， 2、2。其中 在1 号两管事先加入 DMEM 液各2 毫升6 10 分钟后，把三角烧瓶取下，磁力搅拌器关上，用一个吸管轻轻吹打 （使消化下来的细胞彻底从组织团快上掉下来），这个吸管（ 1）用后固定放在 一个离心管中，以后每次消化后取下都用其吹打几下，第一次上清弃去，然后 向两个 1 号管分别倒入 2ml 上清（

7、尽量不要把组织倒出，也不要剩液太多，以 免消化下的细胞重复消化造成损伤），用另一个吸管（ 2）混匀配平两个管（即 两个管水平高度相同），轻轻吹打，以免损坏细胞。7接着把这两个离心管放入离心机中，调 10 分钟， 800 或 1000 转，垫小 锁，打开关。8同时向三角烧瓶中加入 5ml 胰酶，继续消化 8 分钟，注意控制温度。此 时向两个2 号管中分别加入 2mlDMEM 液。9取下三角烧瓶，仍用 1 号吸管吹打，后静置片刻向两个 2 号管分别倒入 2 毫升的上清，取出两个离心后的 1 号管，把上清液沿细胞贴壁一方慢慢倒 掉，后向其中一管加入 4ml 的 DMEM 液，用 2 号吸管取少量液体

8、加入另一个 离心管中，把管底的沉淀细胞洗下来，把液体全部移入其中一管，三个管（ 1 个 1 号管，两个 2 号管）配平，放入离心管中，离心十分钟。同时仍加 5ml 的 胰酶，放入三角烧瓶中，继续消化（注意控制温度，达34C时计时）。10消化到 4 次左右，吹打均匀后，吸一滴滴在载玻片上，拿到镜下观察 消化情况，决定消化次数。11离心 2 次的吸管，放在试管架上，待离心过程全部完事后，把各管上 清液倒掉，在各管加上3ml （不用精确，大致这样）DMEM液，记住共加入多 少 DMEM 液的量，换吸管（ 3 号）把各管底细胞块吸下吹打均匀后，移入 50ml 烧杯中，然后用注射器抽取余量的 DMEM

9、加入烧杯中，加入小牛血清及 抗生素，换吸管（4号）吹打均匀。12取出 24 孔培养板，一个人吹打，另一个人用加样器加药。封盖时过 火，盖上盖，放在CO2孵箱。24小时后观察是否贴壁。（24孔板，每孔最多加2ml，般加液时每孔加11.5ml）配药 ：天平、量筒、烧杯、玻璃棒、二蒸水、硫酸纸。NE：加样器1000p L大头一个或1ml注射器一个，50L小头一个。量 筒100ml，烧杯100毫升。配法：抽取 0.85mlNE 液，放入烧杯，再加二蒸水 99.15ml 补足至 100ml， 备用。在工作台内，用针头滤器滤过（仪器：针头滤器及膜，先试膜，再高压 消毒，注意压力），在一个新的 100ml

10、烧杯内。取 4 个 50ml 的烧杯，分别标 号1、2、3、4。然后用加样器（100卩L）分别取O.lmlNE放入3、4杯内。小牛血清：先配初液，即0.4ml/10ml （用低糖DMEM配，0.4ml牛血清需 500L加样器一个）。配成后即为4%的浓度。分别取0.1ml放入1、2、3、4 号的 50ml 的烧杯内。抗生素：分别取0.1ml放入1、2、3、4号的50ml的烧杯内。分别向1、2、3、4号的50ml的烧杯内加入 DMEM。各为9.7ml、 9.7ml、9.6ml、9.6ml。用4个吸管吹打均匀，然后用加样器每组加1.0ml。另一 人用吸管吸出培养液。每组换一个大头。吡格列酮：取吡格列

11、酮 0.2 克，溶于 2ml 甲醇中，针头滤器滤过用，二蒸 水稀释至5ml，分别取0.2ml加入50ml烧杯内。最后，在各个烧杯内配至10ml水平。共需 11 个烧杯。配液见下图：123456780.04 小牛血清0.04 小牛血清0.04 小牛血清0.04 小牛血清0.04 小牛血清0.04 小牛血清0.04 小牛血清0.04 小牛血清抗生素抗生素抗生素抗生素抗生素抗生素抗生素抗生素NENENENE吡格0.2吡格0.2吡格0.2吡格0.2低糖9.8高糖9.8低糖9.7.高糖9.7低糖9.6高糖9.6低糖9.5高糖9.5小牛血清：先配初液，即0.4ml/10ml （用低糖DMEM配，0.4ml

12、牛血清需500 L 加样器一个）。配成后即为 4%的浓度。分别取 0.1ml 放入 1、 2、 3、 4、5、6、7、8号的50ml的烧杯内。抗生素：取初液1ml,分别取0.1ml放入1、2、3、4、5、6、7、8号的 50ml 的烧杯内。NE:用加样器（100L）分别取0.1mlNE放入3、4、7、8杯内。吡格列酮：取吡格列酮 0.2 克，溶于 2ml 甲醇中，针头滤器滤过用，二蒸 水稀释至5ml，分别取0.2ml加入5、6、7、8烧杯内。1、 3、 5、 7号低糖， 2、 4、 6、 8号高糖。H9C2心肌细胞系的特性首先，它肯定不同于原代细胞系的，最大的区别，原代的心肌细胞基本不能分 裂

13、，而H9C2可以分裂，最大的区别了吧！原代心肌细胞会跳动，你的H9C2 不会吧。虽然都是梭形的，但是H9C2来源于胚胎期心脏，而心肌细胞一般用 新生大鼠分离获得。H9C2与原代心肌细胞有那么大区别，当然不能替代它，所以在研究方向上， 你要根据自己的实验需求选择自己合适的细胞，一般来讲呢，如果你研究与心 脏相关的信号通路，我建议你还是选用细胞系，因为它可以分裂，获得细胞容 易，而且，因为H9C2展现一些成肌细胞特性，所以一般文章都说H9C2做实 验最后说什么什么模拟心肌细胞，他只敢说模拟却不敢说那就是原代心肌细 胞，呵呵，这个时候原代心肌细胞的有点就体现出来了，虽然每次要残忍的杀 害10只鼠崽才

14、获得4大盘，但是人家是会跳动的，是真正的心肌细胞，所以 更接近在体，更能说明问题，如果你的实验要涉及到在体实验，比如说心脏回 植，最好用原代心肌细胞！H9C2细胞系，好像是从美国ATCC细胞库中能查到的一种心肌细胞的细胞系， 尽管购买比较贵(大概5000元人民币左右，当然国内要便宜一些)，但由于已 经是细胞系，具有永生化的特点，所以比原代细胞好养，也方便、实验稳定、 不同批次实验间的差异较小。但其培养基条件不同于普通的DMEM(具体去查 ATCC)。上述三种类型的细胞应该是最好的、能较为真实反应心肌功能的细胞系。 其他尚有一些心肌细胞的替代细胞系，这些都是骨骼肌来源，如常用的是 C2C12肌原

15、细胞系，但与心肌细胞相比，更好养，但特性相差较远，从严格意 义上讲并不能代替心肌细胞。Comme nts: H9c2(2T) is a subclone of the original clonal cell line derived from embryonic BD1X rat heart tissue by B. Kimes and B.Brandt and exhibits many of the properties of skeletal muscle. Myoblastic cells in this line will fuse to form multinucleated myotubes and respond to acetylcholine stimulation.Fusion occurs faster if the serum concentration in the medium is reduced to one percent.Propagation: ATCC complete growth medium: Dulbeccos modified Eagles medium with 4 mM L-glutamine adjusted t