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1、RNA抽提步骤准备：DEPC水配制：1000ml双蒸水中加1mlDEPC,充分振荡使其溶解,放在1000ml容量瓶中静置过夜后备用.配成终浓度为0.1%,室温搅拌过夜,121高压20min,4密封保存.注：DEPC属于一种致癌物质,易挥发,要小心并在通风橱中操作,高压后就会分解,其毒力消失.灭菌：匀浆器、手术器材剪刀、镊子铝箔包好,EP管、枪头三种规格、铝箔、纸 121 60 120minmin；DEPC水 80 30min.其中手术器材用于提取组织RNA.匀浆器180,120min1. 加Trizon裂解细胞：加入适当量的Trizol至细胞中直接加入去培养液平板中后用枪吸出,亦可细胞刮下后离
2、心去上清再加,用量约1ml Trizol每3106、cells.贴壁细胞在遗弃培养基后,可以直接加入Trizol按10cm2 / 1ml Trizol的比例裂解,匀浆一定要彻底.反复吹打以打碎细胞结块,室温放置5min,使其充分裂解.注：此时可以-80长期保存2. 4度,12000g5min离心弃沉淀.萃取除杂蛋白：加入0.2体积的氯仿,立即剧烈摇动充分混匀.混匀后冰上放置15min.3. 4,12000g,离心15min,此时溶液分为三层：下层的酚-氯仿,白色浑浊的中间相多为变性蛋白,水相RNA所在相,小心吸取水相宁可损失,也不要吸到中间相,转移至另一干净RNaseFree EP管中；一般水
3、相的体积为Trizol的60.异丙醇沉淀：向水相中加入0.5倍体积相对于Trizol的异丙醇,充分混匀,混匀后置于-2012h或-8030min,4,12000g,离心5-10min；经过此步可在管底看到白色RNA沉淀；如果起始量大的话,可以加入异丙醇即可观察到微量浑浊,则可直接离心.弃上清,RNA沉于管底.移去上清.4. 75%乙醇DEPC水配制漂洗：加入0.5-1ml 75%乙醇让75%乙醇从沉淀上缓缓流过,温和震荡离心管,悬浮沉淀,7500g 5min转速太大可能会使RNA断裂吸去乙醇,然后用枪吸沉淀附近乙醇,再短暂离心后小心吸出剩余的液体.5. 溶解RNA沉淀：用50ul DEPC水或
4、0.5%SDS溶解RNA样品,5560加热510min.6. 去除二级结构：将RNA放置65水浴锅5min去除二级结构后,迅速放至冰上防止RNA恢复原有结构；7. 测浓度、260/280,260/2308. 检测RNA抽提效果：1% Agarose Gel,220V用大电流跑迅速跑完防止RNA电泳过程中降解,待溴酚蓝跑完全胶的三分之一时,停止电泳观察结果.见下图1.9. RNA保存：-80可长年保存尽量避免放置在4,-20冰箱.Marker D20005S rRNA18S rRNA28S rRNA图1：RNA抽提结果.亮度一般28S18S5S,如果5S rRNA条带过亮,则说明RNA有降解.注
5、：电泳取样量为3l.RNA反转录步骤1) 取总RNA 2g,加入10mM dNTP,OligodT0.5g/l各1l；2) 70度加热5min,冰上放置2min；3) 在同一管中加入10Buffer 2l,RNase抑制剂1l,反转录酶50unit/l1l.4) 轻轻混匀后置于42,60分钟.然后置80,5分钟.RNA2g10mM dNTP1LOligodT0.5g/l1LTRIZOL法抽提RNA准备：DEPC水配制：1000ml双蒸水中加1mlDEPC,充分振荡使其溶解,放在1000ml容量瓶中静置过夜后备用.灭菌：匀浆器、手术器材剪刀、镊子铝箔包好,EP管、枪头三种规格、铝箔、纸 121
6、60 min；DEPC水 80 30min.其中手术器材用于提取组织RNA实验步骤：1 取出储存于-80的组织冷冻管,置于冰浴,准备EP管并做好编号.2 取出米粒大小的组织于灭菌好的铝箔中,包好,敲碎锤子要用灭菌的铝箔纸包好.3 将处理好的组织转移到匀浆器中,加入1ml的TRIzol溶剂尽量将组织全部转移到匀浆器充分匀浆至不见颗粒状物质.4 将充分匀浆好的组织液转移至编号的EP管中,加入200ul氯仿,剧烈振荡后,12000rpm离心15min.5 轻轻取出EP管,小心吸取上清液转移到新的EP管编号,约400-600ul,注意不要吸到第一液相以下的任何物质.6 加入异丙醇500ul,置于-20
7、12h或-8030min,使RNA充分沉淀.12000rpm离心710min.7 加入75%的乙醇DEPC水配制500ul,洗涤后6000rpm离心35min.8 轻倒出上清液,在灭菌的纸上轻叩,盖上盖子后,稍离心.9 小心吸出剩余的液体.10 加入50ul的DEPC水溶解,可以56助溶.11 测定浓度,Nano1000实验 总RNA的提取一、总RNA的提取与定量Trizol试剂适用于从细胞和组织中快速分离RNA.TRIzol的主要成分是异硫氰酸胍和酚.异硫氰酸胍属于解偶剂,是一类强力的蛋白质变性剂,可溶解蛋白质主要作用是裂解细胞,使细胞中的蛋白,核酸物质解聚得到释放.酚虽可有效的变性蛋白质,
8、但是它不能完全抑制RNA酶活性,因此Trizol中还加入了8羟基喹啉、-巯基乙醇等来抑制内源和外源RNase.在加入氯仿离心后,溶液分为水相和有机相,RNA选择性地进入无DNA和蛋白质的水相中.取出水相用异丙醇沉淀可回收RNA；用乙醇沉淀中间层可回收DNA；用异丙醇沉淀有机相可回收蛋白质. Trizol试剂可用于小量样品50100mg组织、5106细胞也适用于大量样品1g组织、107细胞.对人,动物,植物组织,细菌均适用,整个提取过程在一小时内即可完成.分离的总RNA无蛋白质和DNA污染,可用于Northern blot,dot blot,ployA筛选,体外翻译,RNase保护分析和分子克隆
9、.在用于RT-PCR时如果两条引物存在于一个单一外显子内,建议用无RNase的DNase处理RNA样品,避免出现假阳性.共纯化的DNA可用作标准,比较不同样品RNA的得率,也可用于PCR和酶切.蛋白质可用于western blotting.核酸的最大吸收波长为260nm,蛋白质为280nm,在波长260nm时,1OD值相当于双链DNA浓度为50g/ml,单链DNA和RNA浓度为40g/ml,单链寡核苷酸的含量为33g/ml,可以据此来计算核酸样品的浓度,还可通过测定在260nm和280nm的OD值的比值OD260/OD280,估计核酸的纯度.纯净DNA的比值为1.8, RNA为2.0.若样品中
10、含有酚和蛋白质将导致比值降低.270nm存在高吸收表明有酚的干扰.紫外分光光度法只能用于测定浓度大于0.25g/ml的核酸溶液,对浓度更小的样品,可采用荧光分光光度法.仪器和主要试剂：1. 紫外分光光度计、微量加样枪、灭菌超薄PCR反应管2. Trizol试剂3. 氯仿4. 异丙醇DEPC水配制5. 75乙醇6. 无RNase的水或0.5SDS 实验器具的处理与准备1塑料制品：包括吸头、EP管等将塑料制品逐个浸泡于1DEPC水中必要时小枪头需要用吸管打入DEPC水37过夜,然后送至高压3次,后在80烘烤箱中烘干或置于37中8小时左右烘干,试验前将枪头放入吸头台.2玻璃制品：主要是玻璃研磨器先泡
11、酸过夜,冲洗干净后,在1DEPC水中泡8小时左右,37烘干,用蒙锡纸包裹送至干烤3次.以上实验材料我们实验室都是买的Rnase-free的3金属制品：镊子等先洗干净,再送干烤3次.不需要泡DEPC水121两小时再60烘干试剂配制和准备：1DEPC水：泡实验器具的DEPC水的配制：1000ml双蒸水中加1mlDEPC,放在1000ml容量瓶中静置4小时后备用.配75%乙醇的DEPC水的配制：100ml盐水瓶内装40ml双蒸水,加40ulDEPC,37过夜,送至高压.275%乙醇要在抽提时现配：用无水乙醇和DEPC水配制DEPC水：无水乙醇=1：3,然后放于-20备用.3异丙醇：放入棕色瓶4氯仿：
12、放入棕色瓶5Trizol：100ml/瓶存放于4实验方法：一RNA提取1. 匀浆处理:a.组织 将组织在液氮中磨碎,每50-100mg组织加入1mlTrizol,用匀浆仪进行匀浆处理.样品体积不应超过Trizol体积10. b.单层培养细胞 直接在培养板中加入Trizol裂解细胞,每10cm2面积加1ml,用移液器吸打几次.Trizol的用量应根据培养板面积而定,不取决于细胞数.Trizol加量不足可能导致提取的RNA有DNA污染.c.细胞悬液 离心收集细胞,每5-10106动物、植物、酵母细胞或1107细菌细胞加入1ml Trizol,反复吸打.加Trizol之前不要洗涤细胞以免mRNA降解
13、.一些酵母和细菌细胞需用匀浆仪处理. 2. 将匀浆样品在室温15-30放置5 min,使核酸蛋白复合物完全分离.3. 可选步骤：如样品中含有较多蛋白质,脂肪,多糖或胞外物质肌肉,植物结节部分等可于2-8 10000g离心10 min,取上清.离心得到的沉淀中包括细胞外膜,多糖,高分子量DNA,上清中含有RNA.处理脂肪组织时,上层有大量油脂应去除.取澄清的匀浆液进行下一步操作.4. 每使用1mlTrizol加入0.2ml氯仿,立即剧烈振荡15s,室温放置3 min. 5. 2-810000g离心15 min.样品分为三层：底层为黄色红或绿有机相,上层为无色水相和一个中间层.RNA主要在水相中,
14、水相体积约为所用Trizol试剂的60.6. 把水相转移到新管中如要分离DNA和蛋白质可保留有机相,用异丙醇沉淀水相中的RNA.每使用1ml Trizol加入0.5ml异丙醇,室温放置10 min.7. 2-810000g离心10 min,离心前看不出RNA沉淀,离心后在管侧和管底出现胶状沉淀.移去上清.8. 用75乙醇洗涤RNA沉淀.每使用1mlTrizol至少加1ml75乙醇.2-8不超过7500g离心5 min,弃上清.9. 室温放置干燥或真空抽干RNA沉淀,不要晾得过干,否则不易溶解,大约晾5-10min.加入25-200ml无RNase的水,-70保存.二紫外吸收检测RNA的浓度和纯度Nano1000测1. 紫外分光光度计先用水在260nm和280nm两个波长下校零.2. 取RNA样品5l,用水稀释50100倍,转入分光光度计的石英比色杯中.3. 在260nm和280nm分别读出样品OD值.根据260nm时1 OD单位的单链RNA = 40g/ml和稀释倍数,可以计算出样品RNA的浓度和产量. 4. 若OD260/OD280小于2,说明可能有DNA片段污染,可以考虑用无RNase的DNase处理样品,若小于1.8,说明样品中还可能含有蛋白质或酚,应再用酚
