青蒿素综述

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1、青蒿素综述刘兵情(井冈山大学 11 级药本(1)班学号：111116023)摘要：青蒿素类抗疟药物的发现是全球抗疟药物发展史上继奎宁之后的又一里程碑1,是目前治疗疟疾的特效药本文简要介绍青蒿素的发现过程、药源、生 物合成、应用前景和青蒿素及其衍生物药理活性，重点在于介绍青蒿素生物合成 过程。关键词：青蒿素 发现过程 药源 生物合成 药理活性 前景 引言：青蒿素是在科研计划组织下,全国多部门、多学科专家尽心协作、相互配合取得的重大成果，是继承发扬我国传统医药宝库的成功范例2。青蒿素主要有 抗疟、抗孕、抗纤维化、抗吸血虫等药理作用3。青蒿素生物合成三个阶段分为 从乙酰辅酶 A 到法呢基焦磷酸的“上

2、游”途径、从法呢基焦磷酸到双氢青蒿酸 的“中游”途径和从双氢青蒿酸到青蒿素的“下游”途径，其中上游途径青蒿及 其他高等植物与酵母等真核微生物完全相同，因而只需在酵母中额外增加一个青 蒿素合成代谢支路, 就能让酵母全合成青蒿素。而中游的酶促反应在酵母中已经 完全建立，下游途径的反应条件在酵母中则未建立。而且青蒿素及其衍生物在 抗肿瘤和葡萄膜炎免疫治疗上也具有应用前景一青蒿素药物来源1967年北京523抗疟计划付诸实施，1969年1月北京中医研究院 加入523计划,任命屠呦呦为科研组组长，在全国多个研究单位协作下，组织植物化 学与药理学等专业200多人参加，并与中医药工作者密切合作从追索我国历 代

3、抗疟方剂入手， 科研组调查了 2 000 种中草药制剂， 从中选出可能具抗疟活 性的达640种.余亚纲梳理开列了有808个中药的单子，其中有乌头、乌梅、 鳖甲、青蒿等共用约200种国产草药制成380多种抽提物，再筛查它们对小鼠 疟疾模型的疗效,但实验不易获得明显结果军事医学科学院用鼠疟模型筛选了 近百个药方，青蒿提取物的抑制率虽达60%80%，而效力不够稳定继后，研究 组经余亚纲和顾国明复筛，肯定了青蒿的抗疟作用他们也研究了中药常山，其 抗疟作用虽强， 但呕吐的副作用亦强而妨碍推广应用. 转折点出现在黄花蒿的抽 提物.传统中药青蒿包括两个品种：学名黄花蒿(Artemisia an-nua L.

4、)的抽提物 能对小鼠疟原虫的生长显示良好的抑制作用；而学名青蒿 (Artemisia apiaceaHance)则无任何抗疟作用9,继后的实验中，上述结果未能重复，这同中 医文献的记载相矛盾. 为解开此疑惑， 再深入查阅古代医学文献， 最后在晋朝葛 洪著肘后备急方中找到“青蒿一握， 以水二升渍， 绞取汁， 尽服之”的抗疟 记录.惯常煎熬中药的高温抽提法已破坏了抗疟的活性组分；温度高于60 C将 使青蒿素完全分解.在较低温度下进行青蒿抽提后，获得了很满意的效果910，.研究组将青蒿的抽提物分成酸性与中性物部分. 移除了不具抗疟活性且有害的 酸性部分, 重点抽提黄花蒿的叶片 , 使有效成分的产量提

5、高 , 并能大幅度地降低 其毒性6,1971年下半年，于190次实验失败后，他们在60 C用乙醚萃取，制成 了一种无毒性的第 191号中性抽提物.它对感染伯氏疟原虫(Plasmodiumberghei) 小 鼠 以 及 感 染 猴 疟 原 虫 (Plasmodium cyomolgi) 猴 的 疟 原 虫 血 症 (parasitemia) 显示 100%的疗效. 此喜讯宣告了青蒿素课题的新突破. 研究组将 191 号中性抽提物最先在全体组员身上试服 ， 确定了其安全性 .1972 年 3 月， 向“523计划”南京会议报告了试服的结果会后不久，研究组即远赴海南省 安排临床试验.在选试的21例

6、疟疾患者中，感染恶性疟或间日疟(subtertian or tertian malaria)者各占半数.经治疗后，患者的发热症状可迅速消失，血中疟原虫 的数目锐减；而接受氯喹的对照组患者则无效.受到临床试验疗效的鼓舞， 研究组 再回头专攻青蒿素活性组分的分离与纯化 . 钟裕容等通过抽提物的层析 ， 1972 年11月8日成功分离出一种相对分子质量0.282 kD的无色结晶，测得其分子 式为C15H22O5,熔点156157 C ,即“青蒿素II” ,后命名为青蒿素 (artemisinin).1972 年在得知北京科研组有关青蒿粗提物的信息后 ， 山东寄生虫病研究 所与山东省中医药研究所合作

7、， 还有云南省药物研究所分别独立进行黄花蒿的 提取， 亦获得有效抗疟单体， 各自命名为“黄花蒿素” (山东)及“黄蒿素” (云南). 1974年初，上述两种单体被初步确证与北京的青蒿素属相同的药物6。1975年, 在中国科学院上海有机化学研究所、北京生物物理研究所协助下， 刘静明、周维 善等确定了青蒿素的空间结构式.根据光谱数据和X-射线分析以及化学反应, 证明它属于一种新型的倍半萜内酯习。1979年中国国家科学与技术委员会向青蒿 素研究组颁发了国家发明证书，以确认其抗疟疗效5。二青蒿素的生物合成青蒿素的药源主要取自野生黄花蒿和人工栽培的黄花蒿 ， 但前者受地理环 境与季节限制， 而且天然资源

8、逐趋匮乏；后者种植占地大， 耗力费时， 加以植株 易变异，产量不够稳定，因此迫切需要开拓青蒿素的新药源11。由此，有研究者 另辟蹊径，设想通过生物合成青蒿素。时至今日，青蒿素的生物合成已经取得一 定进展，介绍如下：早在 20 世纪 80 年代， 中国科学院上海有机化学研究所汪猷院士领导的 研究小组就利用放射性同位素标记的2-14C-青蒿酸与青蒿匀浆(无细胞系统)保 温法证明，青蒿酸和青蒿B是青蒿素的共同前体12。青蒿素生物合成途径仅见 于青蒿， 但其“上游”途径为真核生物所共有， 可望通过“下游”途径重建， 在 真核微生物(如酵母)中全合成青蒿素. 过去 10 年来， 青蒿素合成基因被国内外

9、研究团队陆续克隆并导入酿酒酵母细胞 ， 已成功合成青蒿酸及双氢青蒿酸等青 蒿素前体. 由于酵母缺乏适宜的细胞环境， 尚不能将青蒿素前体转变成青蒿素 . 因此， 青蒿依然是青蒿素的唯一来源， 凸显出继续开展青蒿种质遗传改良的必要 性. 同时， 青蒿素生物合成的限速步骤尤其是终端反应机制已基本得到阐明 ， 有 助于开展青蒿素形成与积累的环境模拟及仿生 ， 从而为彻底缓解青蒿素的供求 矛盾创造先机4。若以双氢青蒿酸为青蒿素的直接前体，则青蒿素生物合成过程 如下：首先是从乙酰辅酶A经异戊烯基焦磷酸(IPP)、二甲基烯丙基焦磷酸(DMAPP)、法呢基焦磷酸到紫穗槐-4,11-二烯的合成途径，其中DMAP

10、P与IPP 受IPP异构酶(IPPI)催化发生互变，二者再被法呢基焦磷酸合成酶(FDS)作用生 成法呢基焦磷酸，并在紫穗槐二烯合酶(ADS)催化下闭环产生紫穗槐-4,11-二烯； 其次是从紫穗槐-4，11-二烯到双氢青蒿酸的合成途径 ， 紫穗 槐 -4，11- 二 烯 在 细胞色素P450单加氧酶(CYP71AV1)催化下，经连续氧化依次生成青蒿 醇、青蒿醛和青蒿酸其中青蒿醛受青蒿醛双键还原酶2(DBR2)催化而还原成双 氢青蒿醛，后者再在青蒿醛脱氢酶1(ALDH 1)催化下氧化成双氢青蒿酸.双氢青 蒿醇转变成双氢青蒿醛由 ALDH1/CYP71AV1 催化，其逆反应则由双氢青蒿酸还 原酶1(

11、RED1)催化;最后是从双氢青蒿酸到青蒿素的合成途径，双氢青蒿酸经过 未知的多个非酶促反应最终生成青蒿素 . 此外，青蒿酸可能经多步反应合成青蒿 素B后再转变成青蒿素13.青蒿素的生物合成主要任务有：青蒿素前体合成工程菌的构建。在这里 为了便于叙述，将上述青蒿素生物合成过程分为“上游” “中游” “下游” 三个途径，分别是从乙酰辅酶 A 到法呢基焦磷酸的“上游”途径、从法呢基焦 磷酸到双氢青蒿酸的“中游”途径和从双氢青蒿酸到青蒿素的“下游”途径. 青 蒿及其他高等植物与酵母等真核微生物合成法呢基焦磷酸的酶促反应完全相同 (循甲羟戊酸途径) ， 因而只需在酵母中额外增加一个青蒿素合成代谢支路 ，

12、 就能 让酵母全合成青蒿素 . 目前， 中游途径的酶促反应已通过导入青蒿 ADS， CYP71AV1， CPR， DBR2 和 ALDH1 等基因至酵母而得以完全重建， 但下游途 径的反应条件在酵母中则尚未建立4.回溯到2003 年,美国Keasling小组将青 蒿 ADS 基因经密码子优化后导入大肠杆菌中表达， 同时用酵母萜类合成途径代 替大肠杆菌萜类合成途径 ， 首次在细菌体内合成出青蒿素的第一个关键前体 紫穗槐-4，11-二烯， 在 6 L 发酵罐中培养 60 h 的产率达到 450 mg/L14。 2006 年， 他们将 ADS 基因连同 CYP71AV1 和 CPR 基因同时导入酿酒

13、酵母中表达， 培育出世界上第一株生产青蒿酸的酵母工程菌， 经代谢途径修饰与优化， 其产率 已达153 mg/Li5。加拿大Covello小组于2008年将新克隆的青蒿DBR2基 因连同 ADS， CYP71AV1 和 CPR 基因一同导入酿酒酵母，率先培育出合成双氢 青蒿酸的酵母工程菌 ， 其中双氢青蒿酸产率为 15.7 mg/L， 青蒿酸产率为 11.8 mg/Li6。中国医学科学院及北京协和医科大学药物研究所的程克棣小组将青蒿 ADS 基因按酵母偏爱密码子优化并导入酿酒酵母后 ， 也培育出产紫穗槐 -4，11- 二烯的酵母工程菌57。瑞典卡尔马大学的 Brodelius 小组将 ADS 基

14、因导入酵母 中， 分别获得质粒表达及染色体整合表达的产紫穗槐 -4，11-二烯酵母工程菌， 其 中质粒表达酵母工程菌培养16 d后的紫穗槐-4,11-二烯,产量为0.6 mg/Li7。然而， 到目前为止， 国内外还没有一个研究小组将酵母工程菌中的青蒿素 前体转变成青蒿素， 其原因可能是酵母不具备青蒿素合成所需要的细胞环境 4. 这里面临着一个策略选择 ， 即在微生物中合成青蒿素前体后是改用化学方法半 合成青蒿素， 还是继续探索让微生物将青蒿素前体转变成青蒿素的方法 ? 现在 看来， 国外选择的是前者， 并且已先期启动产业化进程. 不过， 从工艺、成本、环 境影响等方面考虑， 实现青蒿素的微生物

15、全合成无疑有着更大的应用价值4. 高产青蒿素转基因青蒿植株的培育。这一步骤首先要寻找高产青蒿素转 基因青蒿培育的有效途径。青蒿素是一种次生代谢产物， 它在青蒿中的积累量很 小， 而且不同地区生态类型的差异很大。中国科学院植物研究所叶和春研究小组 最早开展转基因青蒿研究，他们将重组法呢基焦磷酸合成酶基因(FPS)导入青蒿, 以增加 FPS 基因的拷贝数目， 期望增大青蒿素生物合成途径的碳流“( 开源法”)， 由此获得青蒿素含量比对照高34倍的转基因青蒿发根(0.2%0.3%)18及比对 照高23倍的转基因青蒿植株（0.8%1%）1刃20.类似地，印度科学家用重组羟 甲基戊二酰辅酶A还原酶基因（H

16、MGR）培育转基因青蒿植株,其青蒿素含量提 高22.5%21 将反义鲨烯合酶基因（asSS）导入青蒿，以阻断竞争青蒿素生物合成的 类固醇分支途径 （“节流法” ） , 获得类固醇含量比对照 （0.08%鲜重）下降近一半 （0.04%0.05%鲜重）及青蒿素含量比对照（0.45%干重）提高近 3 倍（1.23%干重）的 转基因青蒿植株22。上海交通大学唐克轩小组利用发夹RNA介导的RNA干扰 技术阻断类固醇合成途径, 使转基因青蒿中的青蒿素含量达到 3.14%干重, 比对 照提高3.14倍23。最近，中国科学院植物研究所的研究小组利用B-石竹烯合 酶cDNA反义片段抑制青蒿的倍半萜合成支路，通过减少B-石竹烯对紫穗槐 -4,11-二烯的竞争，使青蒿素含量提高50%以上24。在今后的研究中，可以考虑将 “开源”与“节流”两种方法结合