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1、样本采集样本米集要注意的重点是， 所采集的临床标本一定要正确和采集的时间合适，并注意采用正确的标本容器，采集的方法程序对有些临床标本非常重要。在疾病发展过程中， 标本采集过早或过晚都可能会给出假阴性结果。尽可能在最短的时间内完成样本的采集（应该保证30min内完成，不适当的处理时间将直接影响和干扰研究的结果），应尽快降低所采集组织样本的温度。肿瘤组织标本的采集和处理应遵循严格的生物安全处理规范，也可根据研究者所提出的特殊要求，按照对方提供的操作模式进行相关处理。（1）患者入院后进行生物安全性检查。检测HIV以及嗜肝病毒 HBV及HCV感染情况。HIV感染患者不列为采集对象。HBV及HCV感染者
2、，须在样本上明确注明。（3） 组织标本取材时间肿瘤外科手术后，标本离体30min内。（4）标本采集每种肿瘤主要采集 3类生物样本，并要保证这些样本的质量和数量能够用于DNA、RNA和蛋白质提取及满足相关的实验分析。1）新鲜组织（包括手术和活检组织）实体组织样本采集包括外科手术切除的或活检和尸检得到的正常、良性和恶性肿瘤组织。手术结束后，在临床肿瘤病理专家的指导下，在不影响病理诊断取材需要的 前提下，采集组织样本。A。 标本取材部位：肿瘤组织、癌旁组织（癌组织旁1cm）和正常组织（癌组织旁 5cm 以外或最远处）。a）临床诊断明确，未经放疗和化疗的手术切除标本，在病理医生指导下取材。b） 尽量保
3、证癌组织没有坏死（有坏死的标本很难提取高质量的RNA和蛋白）。c） 配对癌旁组织”，选择距离癌灶边缘 3 cm范围内的组织样本， 配对正常组织”， 要选择距癌灶边缘 5CM以上或距离癌灶边缘最远段（或手术切缘处）取组织样本，应注明距离。对于空腔器官，如食管、胃、肠、胆囊、膀胱等，“癌旁组织” “正常组织”应取相应部位的“粘膜组织”样本。d） 在保障病理学检测所需标本的前提下，尽量提供足量的肿瘤和癌旁正常组织，一般不少于200mg或10E7细胞。e） 手术切除的组织样本必须迅速置于液氮中，然后保存于液氮罐或-80 C冰箱，这一过 程尽量在手术标本离体后 30分钟内完成。f）其中一块组织可用 OC
4、T处理后冻存，可用于形态学观察和显微切割。（OCT（Optimal Cutting Temperature）包埋剂是一种常用的固形剂。用其包埋组织进行速冻后，能与组织固定成形，有利于保存组织结构完整性，便于其形态结构的分析）B。过程：使用数码相机拍摄标本外观后，将标本切成小块（直径0.5cm x 0.5cm，厚度0.5cm）,为减少处理时间，标本不应切得太小，然后放入冻存管中，标记后放入标本盒中， 盒盖上附有记录标本编号、采集时间及标本类型的标签。每例病人样本保存3-5份冻存管标 本。每份组织重量原则上不低于2g。2）石蜡包埋组织a）中性福尔马林固定手术切除标本按病理学操作规范进行取材b） 取
5、材部位包括癌灶，以及癌灶周围3cm以内的癌旁组织，35cm的近癌组织 和5cm 以外的远癌组织或距癌灶边缘最远段分别取2-3块。取材尽量以癌灶为中心水平向两侧取材，尽量保证足够大的组织样本。取材应该以“远癌-近癌-癌灶”的顺序。癌灶处取材包括癌与正常组织的交界及肿瘤浸润最深处。所有取材的组织块应标明取材部位。c）采集完整的临床病理和随访资料，其中治疗过程和生存期的资料最为关键。3）血液（包括血浆、血清）始终遵循标准防护方法，所有操作均要戴手套。 在抽取静脉血时，应当使用一次性的安全真空采血管取代传统的针头和注射器，因为这样可以使血液直接采集到带塞的运输管和（或）培养管中。用完后自动废弃针头。每
6、例不低于全血10mL，分装两份。以全血作为待测标本时，必须注意抗凝剂的选择，一般使用EDTA-K3或枸橼酸钠，不可使用肝素。全血样本如用于 DNA提取检测，可4C下短期保存，如用于 RNA检测，则应在取 血后尽快提取RNA。a） 及时采集入组病例的外周血标本 ，初诊患者3-5 ml, EDTA抗凝，3000rpm离心，血 浆和有形成份（白细胞成分）分别用统一质量标准的容器保存（尽量在 2h内完成血浆的 分离工作）。b） 特殊病例要保存治疗前后的外周血标本各5 ml （血浆或血清）。c） 采集的血浆或血清样本在无菌条件下分装，0.5-1 mL/每管,用螺纹口管，-80C保存。d） 手术前后血浆或
7、血清，明确临床诊断后在术前取血，术后第14天或出院前取血。e）化疗前后血浆或血清采集按照临床试验操作规程和技术标准制定。f）非癌患者/正常对照血浆或血清样本，选择年龄、性别与实验组相匹配的非癌患者为 对象。2、根据研究课题的具体目标，所采集的生物样本主要用于3类实验研究：1）测试样本：主要用于基因、蛋白表达谱建立，基因组测序分析，样本质量优先。主 要考虑的因素为肿瘤分型和分类，每一类型要达到统计学小样本数目。2） 验证样本：主要用于标志基因变异的确认，进行RT-PCR WB、IHC/ISH、突变检测、 ELISA的实验分析。主要考虑的因素为肿瘤分型、分类和分期，包括不同阶段癌前病变组织样本，病
8、理学诊断要明确，每一类型要保障统计学大样本数目。3）分型样本：主要用于肿瘤标志基因或蛋白的大样本、多中心临床验证，包括IHC,ELISA REAL TIME RT/PCR基因/蛋白临床检测芯片的分析。临床随访资料和生存期为考虑 的主要因素，每一类型要保障符合多中心、大样本的统计学要求。采样及运输容器标本的采集材料如棉签、 拭子等均应为一次性使用， 采样所用的防腐剂、 抗凝剂及相关 试剂材料不应对核酸扩增及检测过程造成干扰。如全血、和血浆样本，首先要抗凝，抗凝剂的选择很重要。一般应使用 EDTA和构橼酸盐作为抗凝剂，肝素因其对 PCR扩增有很强的抑 制作用，且在后面的核酸提取中很难去除，故应尽量
9、避免使用。此外，标本运输中的保存液对其有稀释作用，因此应考虑稀释对测定的影响。现已有厂商专门有用于PCR检测标本采集的无核酸酶容器供应。样本采集中的防污染样本采集最好采用一次性无菌及无核酸酶的材料，不用处理便可直接使用，采集中要特别注意污染，防止混入操作者的头发、表皮细胞、痰液等。如使用玻璃器皿，必须经0.1%DEPC 水处理后高压，以使可能存在的RNase失活，并降解对 PCR有抑制作用的DEPC采样质量的评价血清（浆）标本可观察标本是否溶血、脂血及其程度，并明确这种情况是否会对相应的检 测造成影响。总而言之，标本的收集及适当的预处理，对用于PCR测定的核酸模板的成功提取，具有决 定性作用。
10、附件5 肿瘤样本采集的基本技术标准（适用于部分小量生物样本提供单位使用）1. 所有入组病例要按要求采集肿瘤组织标本、血液和具有临床检测意义的体液。2. 送检肿瘤组织和血液标本最好在未经放疗和化疗前采集。3. 送检肿瘤标本必须病理诊断明确，尽量保证有足够多的癌细胞（50%以上为好）。4. 癌组织没有坏死。（有坏死的标本很难提取高质量的RNA和蛋白）5. 在保障病理学检测所需标本的前提下，尽量提供足量的肿瘤标本和癌旁正常组织， 至少1-2克。6手术标本必须迅速置于液氮中，然后保存于-80 C或-130 C冰箱，这一过程要求在手术离体后30分钟内完成）。7. 如果不能提供与病理学检测平行的活检组织标
11、本，至少提供5-10张组织切片。8. 要提供与病理学检测平行的石腊组织块或福尔马林固定组织标本，或至少提供5-10张组织切片。9. 提供肿瘤脱落细胞涂片或组织印片5-10张10. 及时采集入组病例的外周血标本 ，初诊患者5-10 ml, EDTA抗凝，3000rpm离心，血浆和有形成份分别用统一质量标准的容器保存。特殊病例要保存治疗前后的外周血标本各5 ml （血浆）。附件8 （供参与国际合作的课题组参考）国际肿瘤基因组协作研究（ICGC肿瘤组织样本质量标准三、样本质量标准及操作规范：1. 在ICGC计划实施一开始，就应保证所采用的肿瘤类型和样本的高度均一性。2. 在ICGC计划实施的一开始，
12、应保证使用的肿瘤样本未经过任何治疗，即原发灶，不要复发的肿瘤组织样本，解剖学上为单一起源，并能代表单一组织学类型或亚型，（最好为同一组织病理学级别）。3. 采用样本中的肿瘤细胞要在 80%以上，坏死细胞或正常细胞（炎性细胞，免疫细胞，间质 细胞或癌前病变细胞）应少于20%。某些种类的肿瘤，可能需要适当降低以上标准 ，但是如果 肿瘤细胞数低于60%时，就需要考虑利用一些物理的方法进行富集。4. 需要备有组织学鉴定的文档和图像资料，能够提供给从事特定肿瘤的研究者参考。要明确评估组织的等级 1）坏死；2）碎片;3）炎性组织；4）纤维化；7. 原则上，每例样本需要 200 mg实体瘤组织或 10E7流
13、式细胞仪分选的细胞 （血液肿 瘤）。如果必须采用显微切割分离细胞，具体需要多少细胞还不确定，需进一步明确。8. 虽然需要提取多种大分子，但首先考虑提取高质量的DNA.同样能够提取高质量的RNA=样本处理全血标本血清的分离是临床样本收集中的一项重要内容，所得血清可用来直接检测样本中肿瘤抗原和（或）抗体；分析血清中某种标志物以及相关蛋白表达，进行细胞因子以及DNA和蛋白质的定性和定量分析。临床肿瘤标本库主要采集接受肿瘤外科手术患者之全血标本，采集分为术前、术后两部分。（1） 术前血指临床诊断明确，患者未经任何治疗，即放疗、化疗及免疫治疗等，已 接受上述治疗的患者样本需详细注明。（2） 术后血指接受
14、手术后2周，患者未接受任何治疗，即放疗、化疗及免疫治疗等。采集血清操作时要严格注意安全防护，避免对人、环境造成污染，需认真注意以下事项：1）人员要求：操作时应戴手套以及眼睛和粘膜的保护装置。只有经过严格培训的技术 人员才能进行这项工作。2）实验操作技术要求：规范的操作可以避免或尽量减少喷溅和气溶胶的产生。血液和血清应当小心吸取，而不能倾倒。严禁用口吸液。3）移液管使用后应完全浸入适当的消毒液总。移液管应在消毒液中浸泡适当的时间， 然后再丢弃或灭菌清洗后重复使用。4）带有血凝块等的废弃标本管，在加盖后应防止在适当的防漏容器内高压蒸汽灭菌和 （或）焚烧。5）应备有适当的消毒剂来清洗喷溅和溢出标本。
15、步骤（1） 取血液标本，每例采集10mL （不少于5mL）, ACD （构橼酸盐葡萄糖抗凝剂）抗 凝（或肝素、EDTA首选ACD,其次EDTA，用于细胞培养的血液标本，室温保存；准备 DNA提取的血液标本，4 C保存。约10mL全血分装入红帽管（不含抗凝剂）和紫帽管（含 2%EDTA抗凝剂）中。（2） 红帽管用于分离血清，室温放置30min后离心。紫帽管用于分离血浆。（3）尽快离心（30min内）。此时悬液分为三层，上层为淡黄色血浆，底层为红细胞， 在红细胞层上呈灰白色的白细胞层为外周血淋巴细胞。（4） 轻轻吸取淡黄色血浆上层液放入1.5mL离心管中，每管100卩L,共9管，余液放 入1管中。做好标记，P代表血浆，S代表血清。（5）编号后放入-80C低温冰箱保存。组织组织样本可立即固定，备病例诊断用；或分割后，采取不同方式进行保存。样本DNA、RNA的提取按常规实验方法提取肿瘤组织和癌旁、正常组织的基因组DNA、总RNA石蜡切片用于核酸提取，需先用辛烷或二甲苯脱蜡，再用蛋白酶K消化后即可进行 DNA提取。新鲜组织块的处理步骤首先用生理盐水
