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1、文档供参考，可复制、编制，期待您的好评与关注！ 研究背景：有报道显示我国儿童与青少年的错牙合畸形患病率为67.821。颌面部畸形直接影响到儿童颌面部生长发育、口腔健康、功能和容貌外观以及心理健康。正畸矫治的病患随着生活水平的增加也逐年增多。正畸固定矫治中，很多患者在矫治过程中会出现牙齿表面釉质脱矿的现象。有研究显示，牙齿表面釉质在固定正畸矫治过程的脱矿率大约为 2-97%2, 3。这些现象可能与正畸矫治器的粘接有关，因为在固定矫治过程中牙齿上需要粘接托槽、带环等矫治附件，这些附件可能会使牙齿表面清洁受限、软垢滞留，从而影响口腔健康。但是在临床治疗过程中我们也经常发现，有些正畸固定矫治的患者虽然
2、在矫治过程中软垢很多、口腔卫生很差，而且矫治时间较长，牙面也未出现明显的脱矿现象11。那么在固定正畸矫治过程中的釉质脱矿的原因是什么呢？本研究从微生物学方面对正畸患者佩戴矫治器前后进行菌群测定，分析正畸患者在固定正畸矫治前后口腔菌群的变化及其与口腔健康的关系。研究目的：探讨正畸固定矫治前后患者口内菌群的变化；将患者口腔菌群的变化与患者口腔健康相联系研究两者之间的相关性。研究方法：从 2013 年8月-2014患者中随机选取口内牙齿没有明显脱矿患者20名，于正畸矫治前刮取其上颌前牙牙区菌斑，分为未治疗组组；选取正畸治疗超过六个月并且前牙未出现明显脱矿且口腔健康状况良好患者20名，取同样区域菌斑为
3、正畸治疗组。年8月间在山东大学口腔医院正畸科正在进行固定正畸矫治。取牙面菌斑样本，菌斑基因组DNA提取后PCR扩增，最后对扩增子进行测序和分析，检测正畸前后口内菌群的变化情况。结果：研究结果显示来自正畸治疗组的菌斑多样性与未治疗组没有明显差异（P0.05）。实验测得口腔内约有238个不同的细菌菌属与维持口腔微生态平衡有关。其中10个属的细菌含量较高，占整个口腔的70，分别是Parascardovia，Rothia, Corynebacterium, Leptotrichia, Streptococcus, Selenomonas, Prevotella, Capnocytophaga, Hyl
4、emonella。通过将正畸前后牙面菌斑比较，我们发现有6个属的细菌存在差异。6个属的细菌包括在Parascardovia, Leptotrichia, Corynebacterium，Streptococcus，Selenomonas, 以及Prevotella。我们的实验结果表明，正畸治疗前后菌群结构存在一定的差异性，多种菌属与龋病的发生可能存在正相关或负相关关系，而这种菌属的改变在临床并未引起相应口腔健康的改变，我们可以认为在正畸治疗以后口腔内微生物菌群建立了一个新的稳定生物体系。结论：患者戴用固定矫治器后，出现了局部牙面菌斑中Streptococcus, Corynebacterium
5、, Leptotrichia, Antinomycetes, 以及Lactobacillus总菌群中含量明显增高的情况。本研究结果提示，患者戴用正畸固定矫治器后，局部牙面菌斑中的菌群构成发生改变，并且进入一种新的稳定平衡状态。关键词： 固定正畸治疗 16S rDNA 菌属含量前言临床上正畸患者的口腔卫生的保持一直是比较难以维持的。在临床上我们就经常发现许多固定正畸矫治的患者在矫治过程就发生了牙面脱矿的现象。显然这与牙面菌斑在固定正畸矫治的附件周围聚集有一定的关系4, 5。可能是因为在正畸治疗过程中会出现口内菌群的紊乱，牙周治病菌以及致龋菌比例增多的现象，从而导致牙周炎以及釉质脱矿的发生。有研究
6、显示，固定矫治过程中发生釉质脱矿的概率大约为2-97% 2, 3，其主要表现为脱矿牙釉质表面光泽度下降呈白垩色，影响美观，严重者可导致龋的发生4。也有调查显示固定矫治器粘接6个月内脱矿的发生率明显增加，6-12个月间脱矿发生率也会有所上升1 。另一方面在临床治疗过程中也经常发现，有些接受正畸固定矫治的患者即使在矫治过程中软垢很多、口腔卫生很差，同时矫治时间较长，牙面也未出现明显的脱矿现象以及牙周疾病，在这种情况下口腔内菌群又发生了什么样的变化？本实验使用16S rDNA测序的方法，分析口腔菌群在正畸前后发生的变化。16S rRNA位于原核细胞核糖体小亚基上，包括10个保守区域和9个高变区域，保
7、守区在细菌种属之间没有很大的差距，而高变区域在细菌种属之间有明显的差异。因此，16S rDNA可以做作为分别生物物种的特征核酸序列，已经被广发认为是可以较快且准确分析细菌系统和分类鉴定的指标。以往454测序平台以读长优势广泛应用于16S rDNA测序领域，但是随着MiSeq平台双端PE250和PE300测序策略的发展，读长不断增长，使得基于MiSeq测序研究物种多样性的准确性大幅度提高7，所以已经成为研究微生物群落多样性的首选之策8,9。根据所扩增的16S区域特点，基于Illumina MiSeq测序平台，利用双末端测序（Paired-End）的方法， 构建小片段文库进行双末端测序。通过对Re
8、ads拼接过滤，OTUs(Operational Taxonomic Units)聚类，并进行物种注释及丰度分析，可以揭示样品物种构成；进一步的多样性分析(Alpha Diversity)，多样性分析(Beta Diversity)可以分析样品之间的差异。本研究从微生物学方面应用16S rDNA测序的方法对正畸患者佩戴矫治器前后进行菌群测定，分析在正畸固定矫治前后患者口内菌群的差异及其影响。材料与方法1.实验材料1.1实验试剂（1）PBS缓冲液（上海研域试剂有限公司）（2）Phusion? High-Fidelity PCR Master Mix（New England Biolabs公司）（
9、3）GC缓冲液（New England Biolabs公司）（4）DNA纯化回收试剂盒 （北京天根生化科技有限公司）（5）蓝白斑筛选试剂（上海生工生物工程有限公司）（6）胰蛋白胨、酵母提取物、琼脂粉（上海生工生物工程有限公司）（7）Eppendorf 管（海门市盛邦实验器材有限公司）1.2主要仪器设备（1）DLCJIN型高性能超净工作台 （哈尔滨市东联电子技术公司）（2）MLS3750型高压灭菌器 （日本SANYO公司）（3）MDF一382E型超低温冰箱 （日本SANYO公司）（4）TGL_16G型高速台式离心机（上海安亭科学仪器厂）（5）ND一2000C型微量紫外分光光度计（美国NanoDr
10、op公司）（6）PowerPac 3000型Biorad电泳仪（美国BIORAD公司）（7）1 704406型小型水平电泳槽（美国BIORAD公司 ）（8）GelDoc 2000型凝胶成像系统（美国BIORAD公司）（9）LightCycler 480 RealTime PCR仪（瑞士Roche公司）（10）微量移液器（德国Eppendoff公司）（11）生物安全柜（哈尔滨市东联电子技术开发有限公司）（12）梯度PCR仪（德国Biometra公司）2.实验方法2.1研究对象2.1.1研究对象的选择从 2013 年8月-2014患者中随机选取口内牙齿没有明显脱矿患者20名，于正畸矫治前刮取其上颌
11、前牙牙区菌斑，分为未治疗组组；选取正畸治疗超过六个月并且前牙未出现明显脱矿且口腔健康状况良好患者20名，取同样区域菌斑为正畸治疗组。每位受试者的共同纳入标准：（1）近期居住在山东地区的汉族人群，有相似的饮食习惯；（2）口腔卫生可，没有明显牙周炎，龋病以及釉质脱矿等口腔疾病；（3）近1个月内未使用抗生素、益生菌或益生元等微生态制剂；（4）无其他严重全身疾病及并发症，女性非妊娠期或哺乳期；（5）近1年内未接受过牙周治疗；（6）无吸烟史；（7）年龄在14至28岁。2.1.2对研究对象的年龄分布均衡性检验对患者年龄分布均衡性检验经 2检验结果显示，实验组以及对照组年龄分布具有均衡性（见表 1）表1患者
12、年龄均衡性检验（X+SD,单位：岁）指标分组P值未治疗组正畸组年龄（岁） 19.6+3.31 21+3.28 0.321说明：p值0.05，组间数据结构无显著差异2.2临床参数和标本收集2.2.1 问卷调查问卷主要包括 (姓名、性别、年龄、民族、联系电话、家庭住址、身高、体重、生活等)、全身系统性疾病史、口腔相关信息(是否有刷牙或咬硬物出血、是否有牙齿松动或咀嚼无力、牙周治疗史、牙周炎家族史)。2.2.2临床检查检查患者口内有无龋坏，有无缺失牙齿。使用Williams牙周探针，检查并记录每位受试者现存牙(第三磨牙除外)的牙周临床指标，包括探诊深度(PD)、附着丧失(AL)、探诊出血(BOP)。
13、所有检查均由同一名医师完成。2.2.3实验样本收集选取口腔卫生较好的患者作为实验群体，样本采集时间在饭后 2-4 h，采样前先用清水鼓漱约1min，以除去食物残渣，隔湿、干燥后用无菌探针于患者下颌前磨牙唇颊侧托槽龈方牙面刮取适量菌斑。置于2ml无菌 eppendorf 管（取样前称重并记录其重量，盛有PBS转运液），半小时内送至实验室，再次称重取差值得样本质量。2.2.4 菌斑DNA的分离将存储菌斑标本的缓冲液解冻后，抽提菌斑细菌基因组DNA，具体操作过程如下：（1）解冻后的存有样本菌斑的缓冲液离心，15,000rmp离心十分钟，去除上层清液。（2）在沉淀中加入裂解液ATL，上下颠倒使之混匀。
14、（3）在每管中加入20L蛋白酶K溶液以及锆珠，颠倒使之混匀，在振荡器上振荡3次，每次1min。（4）振荡完成后，在56的水浴箱中静置45min。（5）于每管中加入200L裂解液AL,混合均匀后置于70的水浴箱中40min。（6）加入200L无水乙醇，混合均匀后加入分离柱中，简短离心。（7）丢弃过滤液，把分离柱放入新的收集管中，用AW1，AW2清洗两次。（8）最后用10L洗脱液洗脱DNA两次，提取后的DNA-20保存。2.2.5琼脂糖凝胶电泳检测DNA的纯度和浓度1.制备1%的琼脂糖凝胶，称取0.4g的琼脂糖加入40mlTBE缓冲液中，微波炉中加热至琼脂糖完全融化，在室温条件下冷却到65左右。2
15、.在琼脂糖中加入3.0L锈乙锭贮存液，将其缓慢倒入事先准备好的制胶器中，防止出现气泡，凝胶的厚度控制在0.3-0.5mm，室温下放置至凝胶完全凝固，小心取出梳子，将制备好的凝胶放入电泳槽内。3.在电泳槽内加入TBE缓冲液至液面刚刚淹没凝胶表面。4.将制备好的产物与10上样缓冲液混匀，将其加入到上样孔中，同时在一边加入5.0L的DNA分子maker。5.通电进行电泳，电压100V开始电泳，根据指示剂迁移的位置决定是否停止电泳，观察电泳结果（如图1）。2.2.6 PCR扩增取适量的样品于离心管中，使用无菌水稀释样品至1ng/l。稀释后的基因组DNA为模板；根据测序区域的选择，使用带Barcode的特异引物；使用New England Biolabs公司的Phusion? High-FidelityPCR Master Mix。引物对应区域：16S V4区引物为515F-806R；18SV4区引物为528F-706R；18S
