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1、1. 目的 保证检验前的质量控制，并对合格的标本进行规范的接种，不同类别的标本按照不同的接种方法，选择不同的培养基，有针对性地分离出有临床意义的致病菌。2. 范围微生物实验室所有标本。3. 职责微生物实验室检验人员应遵守本程序。4. 程序4.1 标本接种的优先处理原则所有标本到达微生物实验室后都需及时处理，依据标本的性质，制定标本优先处理的四个水平方针，第一水平的标本需立即接种处理，第四水平的标本可延迟处理，以下为临床标本优先处理的四个水平方针。 水平一标本分类属于“危险的或易被污染的”，是由于疾病入侵性质的严重性或所检测的微生物对环境温度等较敏感，容易死亡。此类标本必须立即处理，包括脑脊液、
2、心包液、血液、支气管肺泡灌洗液、心脏瓣膜。 水平二标本未保护并且能很快退化或污染的菌群能很快大量繁殖，从而改变这些标本的性质，必须很快提供合适生长的环境，使这些标本中营养要求高的微生物得以生长繁殖。此类标本包括痰液、未被列入水平一的体液、组织、伤口分泌物、粪便、脓液等标本。 水平三标本为需要定量的尿液或定量组织活检标本，延迟处理则会影响到标本检出菌量的精密度。 水平四标本为床边接种入培养基中的标本（如放入碱性蛋白胨水、血培养瓶、运送培养基的标本），是具有保护的标本，为了处理好较高水平的标本，水平四标本可以延迟处理。4.2 标本的编号标本的编号规则根据检验目的的不同，按照标本的接收、标识程序中的
3、编号规则进行编号。4.3 标本的处理 血液标本接受标本后，立即对标本进行编号、登记。门诊病人要登记联系方式。将血培养瓶置于全自动血培养仪中培养。抽取血液前，先将血培养瓶颠倒混匀，血培养瓶口用75%酒精消毒。待酒精干燥后，用一次性1ml注射器抽出待检标本，滴少量待检标本在每块平板上的一区。接种在平皿上的标本采用三分区划线法划线。 痰、肺泡灌洗液、支气管毛刷、纤支镜吸痰标本.1 痰标本先用无菌接种环挑取标本涂片。.2 用无菌接种环挑取标本分别涂布于血琼脂平板、巧克力平板、中国蓝平板的第一区，然后再划第二、第三区。 咽拭子、咽喉分泌物标本用拭子分别涂布于血琼脂平板、巧克力平板、中国蓝平板的第一区，然
4、后再用无菌接种环划第二、第三区。 脑脊液标本用无菌接种环挑取标本分别涂布于血琼脂平板、巧克力平板、中国蓝平板的第一区，然后再划第二、第三区。并离心涂片检查。 伤口分泌物、脓液、抽取物、胸腹水等穿刺液床边抽取体液标本510ml注入血培养瓶，若量少时（12ml）可直接置于无菌管中，立即送检。接受标本后，立即对标本进行编号、登记，置孵育箱培养。 粪便或肛拭子标本取粪便脓血或粘液部分标本接种于SS平板和中国蓝平板和血平板。霍乱弧菌培养（不能用肛拭子标本）需接种碱性蛋白胨水、庆大平板和SS平板。 尿标本将尿标本混匀，用10l定量接种环立即接种血琼脂平板、中国蓝平板，分离细菌和菌落计数。 生殖道分泌物标本
5、用拭子分别涂布于血琼脂平板、巧克力平板、中国蓝平板的第一区，然后再用无菌接种环划第二、第三区。淋球菌培养直接接种于巧克力平板上。 以上标本真菌（念珠菌属）培养加种一个沙保罗培养基。4.4 标本的接种方法 平板划线接种法：平板划线接种法是最常用的分离培养细菌的方法，通过平板划线后，可使细菌分散生长，形成单个菌落，有利于从含有多种细菌的标本中分离出目的菌。分离培养用的平板培养基应表面干燥，可在临用前置37孵育箱内30分钟，这样既有利于分离培养，又有利于培养某些对低温敏感的细菌（如脑膜炎奈瑟菌等）。划线接种时，接种环与培养基表面约成45为宜。划线时应尽可能做到置、密、匀，有效地利用培养基表面达到充分
6、分离细菌的目的。如果标本含菌较多，接种在强选择培养基上时或标本含菌较少时，采用分区划线接种，接种环可一直划完各区，不必灭菌。常用平板划线接种法有以下2种 分区划线法.1.1 此法用于痰液、粪便等含较多微生物标本的分离。.1.2 首先将接种环灭菌后冷却，沾取适量标本均匀划线56个往返于平板培养基第一区，将接种环火焰灭菌，待冷却，第二区接触第一区中央34次后连续划线56个来回，依次可分34区，最后烧灼接种环灭菌，每一区细菌数可逐渐减少，直至分离出单个菌落为止。.2 连续划线法.2.1 此法用于含菌量较少的标本（如中段尿）。.2.2 方法是首先用10L定量接种环将标本以均匀直线涂布于平板培养基的中央
7、一条线，然后用接种环在其自左向右连续划线并逐渐向下移动使标本均匀涂布于培养基平板上，不用烧环和分区。 斜面接种法：此法主要用于鉴定或保存菌种，或观察细菌的某些生化特性和动力。其方法为从平板分离培养物上用接种环挑取单个菌落或者是取纯菌种，移种至斜面培养基上，先从斜面底部自下而上画一条直线，再从底部开始向上画曲线接种，尽可能密而匀，或直接自下而上画曲线接种。如移种试管培养物时，可与斜面培养基管同持于左手，右手拿接种环的同时，小指与环指及环指与中指之间各拔取并夹持一个胶塞，取培养物直接接种于斜面培养基上，然后塞上胶塞，火焰灭菌管口和接种环。 穿刺接种法：此法用于保存菌种、观察动力或接种某些生化反应管
8、。其方法是将纯菌插入半固体培养基的中央，穿刺至培养基的底部，然后沿穿刺线退出接种针，其他操作与斜面接种法类似。 液体接种法：本法多用于普通肉汤、真菌肉汤及蛋白胨水等液体培养基的接种。其方法是左手持培养基与菌种管，右手持接种环并夹持胶塞，经火焰灭菌试管口后，以灭菌并冷却后的接菌环沾取菌种，倾斜液体培养基管，先在液面与管壁交界处研磨接种物（试管直立后液体应淹没接种物为准），然后再在液体中摆动23次接种环将标本洗下，塞好胶塞后轻轻混匀。4.5 接种步骤 选择所需的培养基，标明标本编号。 接种环使用前需用电热高温接种灭菌器进行灭菌，方法是将接种环伸入加热孔的高热区，停留57秒或以肉眼可见接种环变红为止
9、。 具体划线接种操作根据具体需要按上述几种接种法进行。 划线接种完毕后，盖好平皿盖、将平板倒置（板盖朝下），试管插入试管架，检查标记号的标本号、接种日期等，按要求放入相应孵育箱培养。参考文献1周庭银编著，临床微生物学诊断与图解（第二版）.上海科学技术出版社,20072叶应妩，王毓三，申子瑜.全国临床检验操作规程.第3版.南京：东南大学出版社，20061.目的规范细菌鉴定标准操作规程。2.适用范围革兰阴性菌、革兰阳性菌等。3.职责检验人员严格执行本程序。4.程序4.1.观察菌落大小、颜色、气味、溶血、形态特征等观察内容应记录在跟单上。4.2.涂片，革兰染色，观察染色性质及细菌形态，大小和排列，球
10、菌、杆菌或螺形菌等内容应记录在跟单上。4.3.初步生化反应：根据菌落特征和涂片结果选择初步生化反应，如氧化酶、触酶、凝固酶（玻片法）等4.4.制定细菌鉴定方案仪器鉴定方案（以ATB为例）.1革兰阴性杆菌 选择ID32E卡。.2革兰阳性球菌 选择ID32STAPH ID32STREP卡。.3 酵母菌 选择ID32C卡（酵母菌鉴定卡）。 手工细菌鉴定方案。.1氧化酶阳性革兰阴性杆菌，选择非发酵鉴定生化反应组合：葡萄糖O/F、木糖、麦芽糖、硝酸盐、动力、七叶苷等生化反应。.2氧化酶阴性革兰阴性杆菌，选择肠杆菌科细菌鉴定生化反应组合：触酶、硝酸盐、葡萄糖O/F、动力、乳糖、VP、吲哚、甲基红、枸橼酸、
11、精氨酸、鸟氨酸、赖氨酸等生化反应。.3疑不动杆菌氧化酶阴性革兰阴性杆菌，选择非发酵鉴定生化反应组合。.4革兰阳性球菌，选择革兰阳性球菌鉴定生化反应组合：触酶、凝固酶、CAMP试验、杆菌肽、胆计七叶苷、葡萄糖O/F、木糖、蔗糖、麦芽糖、硝酸盐、七叶苷、甘露醇等。.5革兰阳性杆菌，选择革兰阳性杆菌鉴定生化反应组合：触酶、葡萄糖O/F、胆汁七叶苷、蔗糖、木糖、甘露醇、硝酸盐、脲酶等。5. 参考文献1周庭银编著，临床微生物学诊断与图解（第二版）.上海科学技术出版社,20072叶应妩，王毓三，申子瑜.全国临床检验操作规程.第3版.南京：东南大学出版社，20061. 目的 规范不染色标本检查法标准操作规程
12、。2. 范围微生物不染色标本检查。3. 职责微生物检验人员严格执行本程序。4. 程序不染色标本的检查法主要用于检查细菌的动力及运动状况。有鞭毛的细菌，在显微镜下呈现活泼的运动。4.1 湿片法用接种环取细菌悬液或细菌培养液2环，置于清洁载玻片中央，轻轻覆上盖玻片，于油镜下观察。制片时菌液要适量，不可有气泡，不可外溢。4.2 悬滴法取洁净的凹窝载玻片及盖玻片各一块，将凹孔四周的平面上涂薄薄一层凡士林，取1接种环菌液置盖玻片中央，将凹窝载玻片的凹面向下，对准于盖玻片的液滴上，然后迅速翻转玻片，用小镊子轻轻压，使盖玻片与凹孔边缘粘紧，使凡士林密封其边缘，菌液不致挥发变干.镜下观察时，先用低倍镜，调成暗
13、光，对准焦距后以高倍镜观察，不可压碎盖玻片。有动力的细菌可见其从一处移到另一处，无动力的细菌呈布朗运动而无位置的改变。螺旋体由于菌体纤细、透明，需用暗视野或位相显微镜观察其形态、活动。4.3 毛细吸管法主要用于检查厌氧菌的动力。以毛细管(长6070mm，管径0.51.0mm)接触培养物，让菌液吸入毛细管后，用火焰将毛细管两端熔封，将毛细管固定在载玻片上，镜检。5. 参考文献1周庭银编著，临床微生物学诊断与图解（第二版）.上海科学技术出版社,20072叶应妩，王毓三，申子瑜.全国临床检验操作规程.第3版.南京：东南大学出版社，20061革兰氏染色原理：革兰氏阳性菌细胞壁上有一层比阴性菌厚的肽聚醣
14、，能与结晶紫紧密结合，不容易被脱色液脱掉，此为染色原理。2试剂组成：(BASO革兰氏染色液)龙胆紫液 碘溶液 脱色液 沙黄溶液3染色方法：3.1涂片待干经火焰固定后，加结晶紫染液染色10秒钟，水洗干净。3.2碘液媒染10秒钟，水洗干净。3.3滴加脱色液脱色，侧动玻片，10-20秒钟，水洗干净。3.4沙黄复染10秒钟，水洗干净，待干，镜检。4结果判断：G+菌呈紫色 G呈红色5影响因素：5.1涂片要均匀，厚度要适当，染妇科白带应稍延长染色时间，以镜检下细菌单个均匀分布为度。5.2微火固定标本，以60为宜。5.3染色时必须按操作规程进行，每次滴加染色液必须覆盖整个涂抹标本。脱色时间要适度，以无紫色流
15、下即可。5.4试剂储存避免高、低温环境及阳光直射。6质量控制：阳性菌对照：金黄色葡萄球菌。阴性菌对照：大肠埃希氏菌。7参考文献：全国临床检验操作规程（第3版）1. 抗酸染色原理：结核菌、麻风杆菌等抗酸性菌，因其菌体表面有一层类脂或脂质的皮膜而不易着色，但一经着色，盐酸酒精的作用也不容易脱色。利用此特性，以增强的染色液予以染色，然后再用盐酸酒精加以处理，使其脱色后再对比染色，此时抗酸性菌仍是固定着最初的颜色（红色），也就易于鉴别。2. 试剂组合：(BASO抗酸染色液)石碳酸复红；盐酸酒精溶液；亚甲基蓝溶液。3. 染色方法：（热染法）3.1在已经固定的涂片上滴加石炭酸复红，使其盖满涂面，徐徐加温，使冒蒸汽，但不可沸腾。染液因蒸发减少时，应随时添加，防止干枯，维持5分钟。3.2待冷却后水洗干净。3.3加盐酸酒精脱色，直到无红色脱落为止，约需2分钟，水洗干净。3.4亚甲基兰复染0.5-1分钟，水洗，待干，镜检。4. 结果判定：抗酸性细菌（结核菌）呈红色。非抗酸性细菌及细胞呈蓝色。5. 注意事项： 5.1玻片应选择新
