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1、实验报告实验题目：细胞RNA的提取及鉴定、RT-PCR检测p53基因的表达报告人：张铨合作者：殷悦涵实验日期： 2016.4.26一、实验原理1. 细胞RNA的提取及鉴定细胞内RNA通常与蛋白质结合，以核蛋白（RNP）的形式存在。分离、制备 RNA时首先须破碎细胞，使RNP释放到溶液中并与蛋白质分离，然后将RNA同其 他的细胞成分分离开并保证RNA的完整性。Trizol法分离提取的RNA产率高、 纯度好且不易降解，它是一种总RNA抽提试剂，可以直接从细胞或组织中提取总 RNA。由于RNase能迅速降解RNA,所以需创造一个无RNase的环境，在各个环 节避免它的污染。评价RNA质量的标准是RN
2、A的均一性和完整性，采用紫外分光 光度法测定RNA的浓度和纯度，纯RNA的A260/280=2.0，实验室条件下一般在 1.7-2.0之间，低于该值说明有蛋白污染，需要进一步抽提。2. RT-PCR检测p53基因的表达PCR是一种体外大量扩增特异DNA片段的分子生物学技术，利用已知序列作 为引物，将两引物之间的特定DNA片段进行复制，经过多次循环是模板上特定 DNA拷贝数呈指数级增长。基本过程为变性、退火、延伸三个步骤循环往复进行, 每一轮过后特定的DNA片段的分子数增加一倍。RT-PCR将mRNA反转录合成cDNA后再经PCR进行大量扩增，实质上是对mRNA 的扩增，常利用此技术克隆cDNA
3、或分析某一特异基因在组织细胞中的表达情况。 本实验先以Oligo引物来反转录合成细胞cDNA模板，然后采用p53特异性引物 进行PCR扩增，最后通过琼脂糖凝胶电泳分析p53在两种肺癌细胞（A549和 H1299 ）中的表达水平。二、实验材料及设备材料：肺癌细胞A549 （野生型）和H1299 （p53缺失型）、p53引物、GAPDH 引物试剂：Trizol试剂、氯仿、异丙醇、无RNase水、乙醇、Promega RT-PCR 试剂盒、2*TaqPCR mix、DNA 染料：GoldView、5*TBE、6*上样缓冲液、DNA 分 子量标准、琼脂糖耗材：Ep管、吸头、一次性手套、口罩设备：541
4、5R型冷冻离心机、NanoDrop2000超微量分光光度计、高压消毒锅、 恒温干燥箱、制冰机、可调式取液器、PCR仪、电泳仪、电泳槽、紫外检测器、 凝胶成像系统、冰箱三、实验步骤1. 细胞RNA的提取及鉴定（一） RNA提取取1* 106个细胞与1.5mlEp管f加0.2ml氯仿摇匀f 4C，12000rpm离心15min分层f取上层水相入新的Ep管中加入等体积异丙醇，摇匀，室温静置lOmin f4C, 12000rpm离心10min，RNA沉淀f弃上清，加1ml75%乙醇洗涤沉淀f4C, 12000rpm离心5minf弃上清，晾干，用30 u l无RNase水溶解沉淀（二） RNA浓度和纯度
5、测定取2ulRNA溶液，用NanoDrop2000超微量分光光度计测定260nm和280nm 波长的OD值，并记录Abs260/Abs280比值及RNA浓度2. RT-PCR检测p53基因的表达（一）反转录合成cDNA1. RNA预变性：取一支0.2mlPCR管加入样品RNA2 u g，以无水RNase水补足 体积至9ul，70C， lOmin，立即置于冰上。2. 设置反转录反应体系，向管内加入MgCl24ul10*RT缓冲液2uldNTP2ulRNaselulOligo (dT)lulAMV反转录酶lul混匀。42C，15min反转录；95C，5min终止反应。置于冰上。（二） PCR扩增目
6、的产物每组做两份模板不同的PCR反应1取两只0.2mlPCR管，分别按下表加入试剂（20u l体系，单位：ul）：试剂Hl299 组A549 组2*TaqPCR mixl0l0p53 上游引物llP53下游引物ll无菌蒸馏水77Hl299细胞cDNA模板lA549细胞cDNA模板l2.设置PCR反应参数为:94C预变性5min94C变性30s58C退火30s72C延伸30s共30个循环72C延伸5min（三）RT-PCR产物鉴定:1.配2%琼脂糖凝胶：琼脂糖2g0.5*TBE100ml微波加热融化；冷却至60C左右，加入GoldView(DNA染料)5 口 l混匀，灌胶2.电泳：向水平电泳槽中
7、加入0.5*TBE至恰好浸没凝胶约1mm左右 取 15 口 1RT-PCR 产物上样，100V 电泳 2030min结果观察：用凝胶成像仪观察并拍摄电泳结果，以DNA分子量标准(marker) 为参照，分析PCR产物大小及p53在两种细胞中的表达情况。理论上，A549是 p53野生型的细胞，正常表达p53,该样品的PCR产物经电泳后，应在390bp的 位置出现扩增条带；而H1299是p53缺失型的细胞，不表达p53，在相应位置没 有扩增条带。管家基因GAPDH作为实验的内部参照，在两种细胞中均有表达，电 泳后在320bp处出现扩增条带。四、实验结果1.细胞RNA的提取及鉴定69A280i C!
8、.； i2.3丄叩:2馭囲由selmr 口w旧:屯罰 巨巴_门并提取到细胞RNA,用NanoDrop2000超微量分光光度计检测其Abs260/Abs280为2.03，浓度为 4.3989 ug/ulo2. RT-PCR检测p53基因的表达五、实验讨论1.细胞RNA的提取及鉴定由于在RNA提取实验中，RNA浓度较高，为4.2ug/ul,导致在取2 口 g的 RNA时，只需取0.5口 l的RNA溶液，移液器的精度不高，容易造成误差，因此 应将溶液稀释至lug/口l左右再取2口g的RNA溶液。Abs260/Abs280为2.02,说明我们组提取的RNA较为纯净，提取步骤操作良 好，几乎没有蛋白质的污染，该溶液可以使用到RT-PCR的实验中。2. RT-PCR检测p53基因的表达可以看到我们组A549细胞中在390bp的位置出现扩增条带，H1299在390bp 处没有出现扩增条带，可说明A549细胞中正常表达p53基因，经过RT-PCR扩增 后在电泳凝胶成像仪中表现出390bp有扩增条带，H1299细胞则不表达p53，不 出现扩增条带。由于我组实验结果为阴性，所以不能看出在实验步骤中混入RNase降解RNA， 但还需在实验步骤中注意佩戴口罩和手套。
