多种质粒提取方法

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1、从细菌中分离质粒DNA的具体操作 材料、设备及试剂一、材料含PBS的E.coliDH5 a或JM系列菌株，1.5ml塑料离心管(又称 eppendorf管)，离心管架。二、设备微量取液器(20p l，200p l，1000p l)，台式高速离心机，恒温振 荡摇床，高压蒸汽消毒器(灭菌锅)， 涡旋振荡器，电泳仪，琼脂糖平板 电泳装置和恒温水浴锅等。三、试剂1、LB 液体培养基(Luria-Bertani):称取蛋白月东(Tryptone)10g， 酵母提取物(Yeastextract ) 5g，NaCl10g，溶于800ml去离子水中，用NaOH 调pH至7.5，加去离子水至总体积1升，高压下蒸

2、气灭菌20分钟。2、 LB固体培养基：液体培养基中每升加12g琼脂粉，高压灭菌。3、氨苄青霉素(Ampicillin，Amp)母液：配成50mg/ml水溶液，-20C 保存备用。4、溶菌酶溶液：用10mmol/LTrisCl( pH8.0 )溶液配制成10mg/ml， 并分装成小份(如1.5ml )保存于-20C，每一小份一经使用后便予丢弃。5、3mol/lNaAc (pH5.2 ) : 50ml 水中溶解 40.81gNaAc3H20，用冰醋 酸调pH至5.2，加水定容至100ml，分装后高压灭菌，储存于4C冰箱。6、溶液 1:50mmol/L 葡萄糖，25mmol/ L T r i s.

3、Cl (pH8.0 )， 10mmol/LEDTA ( pH8.0 )。溶液I可成批配制，每瓶100ml，高压灭菌15分 钟，储存于4C冰箱。7、溶液II： 0.2mol/LNaOH (临用前用 10mol/LNaOH 母液稀释)，1 % SDS。8、溶液III： 5mol/LKAc60ml ，冰醋酸 11.5ml，H2O28.5ml，定容至 100ml， 并高压灭菌。溶液终浓度为：K+3mol/L，Ac5mol/L09、RNA 酶 A 母液：将 RNA 酶 A 溶于 10mmol/LTrisCl( pH7.5 )， 15mmol/LNaCl 中，配成 10mg/ml的溶液，于100C加热15

4、分钟，使混有的DNA酶失活。冷却后用 1.5mleppendorf管分装成小份保存于-20C。10、饱和酚：市售酚中含有醌等 氧化物，这些产物可引起磷酸二酯键 的断裂及导致RNA和DNA的交联，应在160C用冷凝管进行重蒸。重蒸酚加 入0.1 %的8-羟基喹啉(作为抗氧化剂)，并用等体积的0.5mol/LTrisCl(pH8.0 )和0.1mol/LTrisCl( pH8.0 )缓冲液反复抽提使之饱和并使其 pH值达到7.6以上，因为酸性条件下DNA会分配于有机相。11、氯仿：按氯仿：异戊醇=24: 1体积比加入异戊醇。氯仿可使蛋白 变性并有助于液相与有机相的分开，异戊醇则可起消除抽提过程中出

5、现的 泡沫。按体积/体积=1： 1混合上述饱和酚与氯仿即得酚/氯仿(1:1)。酚和氯仿均有很强的腐蚀性，操作时应戴手套。12、TE 缓冲液：10mmo/LTrisCl( pH8.0 ), 1mmol/LEDTA (pH8.0 )。 高压灭菌后储存于4C冰箱中。13、STET: 0.1mol/LNaCl ,10mmol/LTrisCl( pH8.0 ) , 10mmol/LEDTA (pH8.0 ) , 5%TritonX-100。14、STE: 0.1mol/LNaCl ,10mmol/LTrisCl( pH8.0 ) , 1mmol/LEDTA (pH8.0 )。15、电泳所用试剂：(1)T

6、BE缓冲液(5X):称取Tris54g ,硼酸27.5g , 并加入 0.5MEDTA (pH8.0 ) 20ml，定溶至 1000ml。( 2)上样缓冲液(6X)： 0.25%漠酚蓝，40% ( w/v )蔗糖水溶液。操作步骤一、细菌的培养和收集将含有质粒pBS的DH5 a菌种接种在LB固体培养基(含50 p g/mlAmp ) 中，37C培养12-24小时。用无菌牙签挑取单菌落接种到5mlLB液体培养基(含50p g/mlAmp )中，37C振荡培养约12小时至对数生长后期。二、质粒DNA少量快速提取质粒DNA小量提取法对于从大量转化子中制备少量部分纯化的质粒DNA十分有用。这些方法共同特

7、点是简便、快速，能同时处理大量试样，所得 DNA有一定纯度，可满足限制酶切割、电泳分析的需要。(一) 、煮沸法1、将1.5ml培养液倒入eppendorf管中，4C下12000 &离心30秒。2、弃上清，将管倒置于卫生纸上几分钟，使液体流尽。3、将菌体沉淀悬浮于120mlSTET溶液中，涡旋混匀。4、加入10ml新配制的溶菌酶溶液(10mg/ml )，涡旋振荡3秒钟。5、 将eppendorf管放入沸水浴中，50秒后立即取出。6、用微量离心机4C下12000g离心10分钟。7、用无菌牙签从eppendorf管中去除细菌碎片。8、取20ml进行电泳检查。注意1.对大肠杆菌可从固体培养基上挑 取单

8、个菌落直接进行煮沸法 提取质粒DNA。2.煮沸法中添加溶菌酶有一定限度，浓度高时，细菌裂解效 果反而不好。有时不同溶菌酶也能溶菌。3.提取的质粒DNA中会含有RNA, 但RNA并不十扰进一步实验，如限制性内切酶消化，亚克隆及连接反应等。(二) 、碱法1、取1.5ml培养液倒入1.5mleppendorf 管中，4C下12000g离心30 秒。2、弃上清，将管倒置于卫生纸上数分钟，使液体流尽。3、菌体沉淀重悬浮于100p l溶液I中（需剧烈振荡），室温下放置 5-10分钟。4、加入新配制的溶液II200 p 1,盖紧管口，快速温和颠倒eppendorf 管数次，以混匀内容物（千万不要振荡），冰浴

9、 5分钟。5、加入150p 1预冷的溶液III，盖紧管口，并倒置离心管，温和振荡 10秒，使沉淀混匀，冰浴中5-10分钟，4C下12000g离心5-10分钟。6、上清液移入干净eppendorf管中，加入等体积的酚/氯仿（1:1 ）， 振荡混匀，4C下12000g离心5分钟。7、将水相移入干净eppendorf管中，加入2倍体积的无水乙醇，振荡 混匀后置于-20C冰箱中20分钟，然后4C下12000g离心10分钟。8、 弃上清，将管口敞开倒置于卫生纸上使所有液体流出，加入1ml70 % 乙醇洗沉淀一次，4C下12000g离心5-10分钟。9、 吸除上清液，将管倒置于卫生纸上使液体流尽，真空干燥

10、10分钟 或室温干燥。10、将沉淀溶于20p lTE缓冲液（pH8.0，含20 p g/mlRNaseA ）中，储 于-20C冰箱中。注意1.提取过程应尽量保持低温。2.提取质粒DNA过程中除去蛋白 很重要，采用酚/氯仿去除蛋白效果较单独用酚或氯仿好，要将蛋白尽量除 干净需多次抽提。3.沉淀DNA通常使用冰乙醇，在低温条件下放置时间稍 长可使DNA沉淀完全。沉淀DNA也可用异丙醇（一般使用等体积），且沉 淀完全，速度快，但常把盐沉淀下来，所以多数还是用乙醇。（三）、Wizard少量DNA纯化系统Promega公司的Wizard少量DNA纯化系统可快速有效的抽提质粒 DNA， 整个过程只需15分

11、钟。提取的质粒可直接用于DNA测序、酶切分析和体外 转录等。该系统中所含试剂和柱子可以用于 50次1-3ml质粒培养液的分离 和纯化，试剂包括10ml细胞悬浮液，10ml细胞裂解液；10ml中和液， 50mlWizard少量DNA纯化树脂，50ml柱洗液（使用前加95%乙醇至120ml ） 和50支Wizard微型柱。1、1-3ml过夜培养细胞液4C下12000g离心1-2分钟。2、去除上清液，菌体细胞悬浮于200p l细胞悬浮液中，充分混合， 并移入eppendorf管中。3、加200p l细胞裂解液，颠倒离心管数次，直到溶液变清亮。4、加200p l中和液，颠倒离心管数次。5、4C下120

12、00g离心5分钟，取上清液于新的eppendorf管中。6、加1mlWizard少量DNA纯化树脂，颠倒离心管数次以充分混匀。7、取一次性注射器，取出注塞，并使注射筒与Wizard微型柱连接， 用移液枪将上述混合液加入注射筒中，并用注塞轻推，使混合物进入微型 柱。8、将注射器与微型柱分开，取出注塞，再将注射筒与微型柱相连，加 入2ml柱洗液，并用注塞轻推，使柱洗液进入微型柱。9、取出微型柱置于eppendorf管中，离心2分钟以除去微型柱中的柱 洗液。10、将微型柱放在一个新eppendorf管中，加50 1TE （或水）于微型 柱中，静止1分钟后，4C下12000g离心20秒。11、丢弃微型

13、柱，将eppendorf管中的质粒DNA贮于4C或-20C冰箱。注意树脂使用前应充分混匀，如有结品，可将树脂用 25- 37C水浴处 理10分钟。三、质粒DNA的大量提取和纯化在制作酶谱、测定序列、制备探针等实验中需要高纯度、高浓度的质粒DNA，为此需要大量提取质粒DNA。大量提取的质粒DNA 一般需进一步纯 化，常用柱层析法和氯化绝梯度离心法。（一）、碱法1、取培养至对数生长后期的含pBS质粒的细菌培养液250ml，4C下 5000g离心15分钟，弃上清，将离心管倒置使上清液全部流尽。2、 将细菌沉淀重新悬浮于50ml用冰预冷的STE中（此步可省略）。3、同步骤1方法离心以收集细菌细胞。4、

14、将细菌沉淀物重新悬浮于5ml溶液I中，充分悬浮菌体细胞。5、加入12ml新配制的溶液II，盖紧瓶盖，缓缓地颠倒离心管数次， 以充分混匀内容物，冰浴10分钟。6、加9ml用冰预冷的溶液III，摇动离 心管数次以混匀内容物，冰上放置15分钟，此时应形成白色絮状沉淀。7、4C下5000g离心15分钟。8、取上清液，加入50mlRNA酶A （ 10mg/ml ），37C水浴20分钟。9、加入等体积的饱和酚/氯仿，振荡混匀，4C下12000g离心10分钟。10、 取上层水相，加入等体积氯仿，振荡混匀，4C下12000g离心10 分钟。11、取上层水相，加入1/5体积的4mol/LNaCl和10%PEG（

15、分子量6000 ）， 冰上放置60分钟。12、4C下12000g离心15分钟，沉淀用数ml70%冰冷乙醇洗涤，4C下 12000g离心5分钟。13、真空抽十沉淀，溶于500mlTE或水中。注意1.提取过程中应尽量保持低温。2.加入溶液II和溶液III后操 作应混和，切忌剧烈振荡。3.由于RNA酶A中常存在有DNA酶，利用RNA酶耐热的特性，使用时应先对该酶液进行热处理（80C1小时），使DNA酶失活。（二）、Wazard大量DNA纯化系统碱法大量提取DNA往往需要很长的时间.Promega公司的Wiazrd大量 DNA纯化系统既简单又快速，只需要离心和真空抽十，这个系统可以从500ml 培养液中在3小时以内获得1mg以上的高质量的质粒DNA （ 200-20000bp ）。 该系统不需要酚和氯仿抽提，纯化后的DNA溶于水或TE缓冲液中，不含任何盐份，可以直接用于DNA序列分析和酶切反应，也可以用于在 核酸酶抑 制剂（如RNasin ）存在的条件下进行体外转录反应等。该系统中含有的试 剂和柱子可以用于10次100-500ml质粒培养液的分离和纯化，试剂包括： 150ml细胞悬浮液，150ml细胞裂解液，150ml中和液，100mlWizard大量