细胞培养方法

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1、2007-10-03 |软琼脂集落形成率实验（软琼脂克隆）护分享将1.2%低熔点琼脂糖与2x细胞培养基以1:1的体积比混合制备 0.6%的底层琼脂，6孔板中每个孔14ml温室凝固，取对数期细胞, 胰酶消化后吹散成单个细胞悬液，计数，并调细胞浓度为10000个 /ml,将0.6%低熔点琼脂糖与2x细胞培养基以1:1的体积比混合， 制备03%的上层琼脂,每孔加1ml上层琼脂和100ul单细胞悬液（约 1000cell/well）,混匀，室温凝固。置于37C, 5%CO2的细胞培养 箱中培养2 3周，计数含50个细胞以上得克隆，计算细胞集落形成 率，Spotll采集图像。2007-10-03 | M

2、TT检测细胞增殖及见解护分享细胞以每孔3000个接种至96孔板，分成不同组，每组3孔，利用含 有10%胎牛血清的DMEM培养液培养24 h之后，向培养液中加入 一定工作浓度的药物（单体或混合物），继续培养24 h或48h。培养 结束，直接向每孔加入5mg/ml的MTT 10pl,孵育24小时（应常 在显微镜下观察）。去除培养液，每孔加入DMSO 100pl,充分振荡 3分钟，立即在酶标仪上测定490nm的吸光度值。由于这种方法基于琥珀酸脱氢酶的活性，因而加入MTT之后应该在显 微镜下观察，药物是否可以改变细胞琥珀酸脱氢酶的活性。若是改变则 不可以使用此种方法。另有根据细胞ATP含量测定细胞增殖

3、的方法，但是都要考虑药物对细 胞ATP是否有影响。所以测定细胞增殖，最简单，最原始，最麻烦的方法，进行细胞计数我们感觉还是最好的方法。细胞培养方法哺乳动物细胞培养规则：1， 严格按照细胞培养室规则进行哺乳动物细胞，由于细胞为整合生物中心共用，使用紧张， 在使用时尽可能提高速度，保证操作规范。2， 使用细胞间之后，主动将安全柜台面和桌面等清理整齐干净。3， 在自己培养细胞出现污染之时，及时通报同一培养箱培养细胞者，并将培养相关细胞的培 养液/PBS/胰酶等全部清出细胞培养室，以减轻对细胞培养的影响。4，实验所用细胞培养原则要求：A,细胞复苏之后两代开始使用；B,保证细胞每次传代前密 度不超过90

4、%； C,细胞使用最多12代（约2个月）。5， 最好每天观察细胞生长状态，若有异常及时处理。6， 具体参照www.atcc.org中细胞培养要求。细胞传代方法1， 将长至80-90%细胞的培养瓶中原来的培养液弃去。2， 加入0.51ml 0.25%胰酶溶液，使瓶底细胞都浸入溶液中。3，瓶口用瓶盖盖好，放在倒置镜下观察细胞。随着时间的推移，原贴壁的细胞逐渐趋于圆 形， 在还未漂起时将胰酶弃去，加入适当体积的培养液终止消化。观察消化也可以用肉眼，当见到瓶 底发白并出现细针孔空隙时终止消化。一般室温消化时间约为1一3分钟。根据不同细胞而异。4，用吸管将贴壁的细胞吹打成悬液，尽可能的避免气泡产生，分到

5、另外两到三瓶中，置37C 下继续培养。第二天观察贴壁生长情况。5，细胞培养液参照www.atcc.org，一般含有10%胎牛或小牛血清。96/24孔板传代:1, 前同于普通细胞传代方法。2, 细胞吹打均匀后，对细胞进行计数，根据需要调至适当浓度。例如：每孔传代10000个 细胞，可以将细胞调至浓度十万，之后利用排枪，吸取100ul，至96孔板中。3，24孔板，采用1ml移液器进行传代。细胞冻存方法1， 预先配制冻存液：含90%FBS, 10%DMSO的冻存液，DMSO液用培养液配好，避免因临时配制产热而伤害细胞；2，取对数生长期细胞，经胰酶消化后，加入适量冻存液，用吸管吹打制成细胞悬液（1x1

6、06亠5 x106 细胞/ml）；3， 加入1ml细胞于冻存管中，密封后标记冷冻细胞名称/冷冻日期/操作者。4， 放于程序降温盒，之后在-80C冰箱过夜。5， 将程序降温盒中细胞放于液氮保存。6， 要保证冻存细胞数量。细胞复苏方法1， 从液氮中取出冷冻管，迅速投入3738 C水浴中，不断摇动使其融化（1分钟左右）；2， 尽快用培养液稀释至原体积的10倍以上；3， 低速离心10分钟，1000转；4， 去上清，加新鲜培养液培养刚复苏的细胞。5， 尽快对复苏细胞进行换液。6， 扩大培养后，再冻存至少复苏数量的细胞，以保证细胞库的完整。细胞计数1、将血球计数板及盖片用双蒸水擦试干净，并将盖片盖在计数板

7、上。2、将细胞悬液吸出少许，滴加在盖片边缘，使悬液充满盖片和计数板之间。3、静置3分钟。4、镜下观察，计算计数板四大格细胞总数，压线细胞只计左侧和上方的。然后按下式计算：细胞数/ml=4大格细胞总数/4X10000实验前准备下列物品：双蒸水瓶子（500ml、250ml），离心管，tip头，Eppendorf管，滤 纸，餐巾纸，微量加样器20-50plo 具体实验步骤如下：细胞总蛋白的提取利用RIPA细胞裂解液，提取经处理细胞的总蛋白，根据RIPA试剂盒提取步骤如下：1, 收集细胞，加入300plRIPA和3plPMSF （不可以预先加入PMSF），利用枪头吹打，放置 于冰上30min2, 将样

8、品于4C、30min、20000g离心3, 小心将上清液转移到新的离心管中，分装成每管25pl，于一70C保存4, 两份5pl的细胞裂解液，稀释10倍之后，利用BCA法测定蛋白质浓度。利用BCA100蛋白质定量测定试剂盒（购自上海申能博采生物科技有限公司）测定蛋白质 浓度，步骤如下1，SolutionA and SolutionB混合液（根据需要确定混和量,A： B=50： 1）A,绘制标准曲线和加样，如下表34：1457BSA （川）01.25 2.55A+B （|jl）10098.7597.595OD5700.0050.0630.1230.243OD5700.0030.0670.1280.

9、245OD5700.0060.0650.1200.248OD570 （平均值）0.00460.0650.12330.245浓度(|jg/ml)0100250500B, 将上述加好的样品放于酶标板C, 将酶标板放于37C摇床放置30minD, 取出酶标板，利用酶标仪测定其OD570 巳绘制标准曲线，如图：3-1巳根据标准曲线测定样品的浓度。F,稀释之后样品浓度测定值如下表3-5：NaF浓度04mM 6mM 8mM样品量（pl）5555A+B (pl)95959595OD5700.0950.0900.0990.080OD5700.0900.0860.0960.086OD5700.0980.0890

10、.0980.085OD570 （平均值）0.0940.0880.0980.084浓度（pg/ml）179.7167.0188.2158.6配制SDSPAGE胶将垂直电泳用玻璃，先用自来水冲洗多次，之后利用蒸馏水冲洗干净，放置于烘箱中烤干，将玻 璃放置在制胶架上，根据上述PAGE胶的配置方法配制分离胶，之后将配制胶灌于两个玻璃之 间至距梳齿0.5cm或距玻板1.5cm处标记（胶会收缩）。加入一层异丁醇厚约1cm，置 30-45mi n,两者之间会出现一条明显的界线，量分离胶的宽度，倒出，冲洗（1xTris/SDS, PH8.8）未聚合的丙烯酰胺，滤纸（普通）吸干（带手套，Whatman3mm滤纸

11、）。加入积层胶，插梳子，置30-45min,拔梳子，冲洗（蒸馏水）未聚合的丙烯酰胺，把凝胶固 定于电泳装置，加入1x电泳缓冲液，排出凝胶底部两玻板间的气泡（注射器弯90C），不要 预电泳，以免破坏缓冲系统的不连续性。加样（冰上） 加样缓冲液用前加 50l B -巯基乙醇至 95O|J| sample buffer （5|jI-95|jI, 10|jI-190|jI, 15pl-285pl, 20pl-380pl）, sample buffer 稀释样品（100pg 总蛋白，至少 30pg）至少 1： 2,总体积v25|jl （30-45川），约20|jl （可用水试验一下），100C 5min

12、,冲洗加样孔， 加样，注意加样均匀，水冲洗枪头于餐巾纸。最外侧加等量样品缓冲液，避免边缘效应，或MARK （预染蛋白质marker）加样孔。电泳和取胶正负极正确连接，80v, 90-120min（1h），电泳至溴酚蓝到达凝胶底部为止；关闭电源，带手 套（防止油脂阻碍蛋白转膜）将胶取出放于一吸水纸上，备盒子，转移液多一点，撬玻璃，浸湿 一下，刮下最左边的两个加样齿做标记，玻璃作尺子，切积层胶，垫片挑下，转移缓冲液，摇 30mi n。电转（带手套，油脂阻碍蛋白转膜）利用电转缓冲液浸泡滤纸15min,并利用甲醛浸泡PVDF膜5min,再用电转缓冲液浸泡PVDF 膜10min,之后按照大滤纸-膜-胶-

13、纸（试管赶气泡）放置于电转设置，于冰中电转，350mA, 120min,看电流，取膜，切硝酸纤维膜的右上角标记（参考分子克隆红皮P366）此步之后可以利用丽春红染液检测转膜效果，并记录蛋白Marker的位置，确定电转效果。然后 再利用蒸馏水洗涤多次，可以将丽春红染液洗掉，继续进行下面实验。封闭将膜浸于封闭液（含有5%脱脂奶粉，0.1%（v/v）的PBS-T或者TBS-T）中，在水平脱 色摇床上，室温2.5h。之后快速利用wash buffer洗涤一次15min,再洗两次各5min。加入一抗首先按要求将一抗利用PBS-T或TBS-T稀释，将PVDF膜放于杂交袋中，按0.1ml/cm2 比例加入一

14、抗稀释液，放于4C冰箱过夜；之后浸于Wash buffer，按照4ml/cm2室温洗涤 一次15min,之后利用新鲜的Wash buffer2x5min洗涤。加入二抗将二抗按照要求进行稀释于PBS-T或TBS-T中，室温将膜浸于二抗，放于脱色摇床2.5h, 之后和步骤8 一样洗涤。染色将kit中的solution1和solution2等体积混和，之后按照0.125/cm2等体积覆盖于膜上（蛋 白面向上，膜放于平面上），室温放置1mi n,将膜利用镊子赶走多余的detecto n reage nt显影 将膜蛋白面向上，放于Xray Film cassette,在暗室中将film放于膜上，盖上ca

15、ssette, 5 分钟。快速冲洗，之后放于第二个film，放置10min.将冲洗的胶片放于室温凉干。2007-09-29 |定量PCR技术思考*分享定量PCR现在已经是一种常规的生物学实验技术手段，俺也有相当一段时间采用这种技术来分 析基因的表达。现将此技术与大家分享。其实我认为定量PCR最常用的是相对定量，其实和我们以前的半定量PCR 一样，只是此技术的 升级版本。定量PCR最大的麻烦是特异性和污染问题。特异性主要当然是引物的设计，所以我主张：首先采用别人发表的引物为佳。当然采用的paper的级别要高点为好，例如PNAS以上等，这 样的可信度高。其次就是自己设计，设计的原则在takara的定量PCR宣传册已经非常的详细，但是一般来说 很难能够达到完全符合要求。这样最好设计两对以上的引物，进行定量PCR。定量PCR是要看 溶解曲线的，而且要关心溶解曲线峰的宽度，但是这个不是很准确，从严格的角度来说，还要在 定量PCR之后，将产物进行电泳检测，看是否特异。若是特异才可以采用这种方法。再次