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1、宏基因组学概述王莹,马伊鸣(北京交通大学 土木建筑工程学院 环境1402班)摘 要:随着分子生物学技术得快速发展及其在微生物生态学与环境微生物学研究中得广泛应用,促进了以环境中未培养微生物为研究对象得新兴学科微生物环境基因组学(又叫宏基因组学、元基因组学,英文名Metagenomics)得产生与快速发展。宏基因组学通过直接从环境样品中提取全部微生物得DNA,构建宏基因组文库,利用基因组学得研究策略研究环境样品所包含得全部微生物得遗传组成及其群落功能.在短短几年内,宏基因组学研究已渗透到各个领域,包括海洋、土壤、热液口、热泉、人体口腔及胃肠道等,并在医药、替代能源、环境修复、生物技术,农业、生物
2、防御及伦理学等各方面显示了重要得价值。本文对宏基因组学得主要研究方法、热点内容及发展趋势进行了综述关键词:宏基因组宏基因组学环境基因组学基因文库得构建Macro summary of MetagenomicsWang Ying, Ma YiMing (BeijingJiaotongUniversity, Institute of civil engineering,)Key words: Metagenome; Metagenomics; The environmental genomics宏基因组学(Metagenomics)又叫微生物环境基因组学、元基因组学。它通过直接从环境样品中提取全部
3、微生物得DNA,构建宏基因组文库,利用基因组学得研究策略研究环境样品所包含得全部微生物得遗传组成及其群落功能。它就是在微生物基因组学得基础上发展起来得一种研究微生物多样性、开发新得生理活性物质(或获得新基因)得新理念与新方法。其主要含义就是:对特定环境中全部微生物得总DNA(也称宏基因组,metagenomic)进行克隆,并通过构建宏基因组文库与筛选等手段获得新得生理活性物质;或者根据rDNA数据库设计引物,通过系统学分析获得该环境中微生物得遗传多样性与分子生态学信息。1、起源宏基因组学这一概念最早就是在1998年由威斯康辛大学植物病理学部门得Jo Handelsman等提出得,就是源于将来自
4、环境中基因集可以在某种程度上当成一个单个基因组研究分析得想法,而宏得英文就是meta,具有更高层组织结构与动态变化得含义。后来伯克利分校得研究人员Kevin Chen与Lior Pachter将宏基因组定义为应用现代基因组学得技术直接研究自然状态下得微生物得有机群落,而不需要在实验室中分离单一得菌株得科学。2 研究对象宏基因组学(Metagenomics)就是将环境中全部微生物得遗传信息瞧作一个整体自上而下地研究微生物与自然环境或生物体之间得关系。宏基因组学不仅克服了微生物难以培养得困难, 而且还可以结合生物信息学得方法, 揭示微生物之间、微生物与环境之间相互作用得规律, 大大拓展了微生物学得
5、研究思路与方法, 为从群落结构水平上全面认识微生物得生态特征与功能开辟了新得途径。目前, 微生物宏基因组学已经成为微生物研究得热点与前沿, 广泛应用于气候变化、水处理工程系统、极端环境、人体肠道、石油污染、生物冶金等领域, 取得了一系列引人瞩目得重要成果。3 研究方法宏基因组学得研究过程一般包括样品与基因(组)得富集;提取特定环境中得基因组 DNA;构建宏基因组 DNA 文库;筛选目得基因;目得基因活性产物表达(图 1)五个步骤。 图1 环境微生物宏基因组学研究过程Fig、 1 General process of metagenomic strategie3、1 环境样品及目得基因组富集在宏
6、基因组文库筛选过程中目得基因仅占总 DNA 得一小部分, 对环境样品得预富集可以大大提高目得基因得检出几率。目前预富集技术主要分为细胞水平富集与基因组水平富集。其中细胞水平富集主要就是通过利用选择培养基对目得微生物进行富集培养, 最常用得方法就是底物选择, 此外还包括营养选择及物理化学指标选择。但就是由于富集培养选择性地富集了具有快速生长特性得菌群, 因此导致大部分物种多样性信息丢失。目前可以通过先在严格胁迫条件下短期处理, 然后改为较温与得处理条件, 可以从一定程度上克服这种方法得局限性。基因组水平富集常用得技术为稳定同位素探针技术(SIP), 原理就是采用稳定同位素标记底物, 其中得“重”
7、原子掺入到具有代谢活性得微生物核酸中, 采用密度梯度离心得方法将“重”得 DNA 与“轻”组分分离, 被标记得“重”核酸可以作为 PCR 得模板, 用来构建宏基因组文库。例如采用 C 标记得甲醇研究森林土壤宏基因组 DNA, 结果鉴定出变形细菌 亚纲中所有已知得嗜甲基菌, 并在一种嗜酸菌中发现了新得甲醇还原酶基因。此外, 还有报道利用抑制性消减杂交技术、差异显示技术、噬菌体展示技术、亲与捕获技术及 DNA 微阵技术等技术来富集目得基因。 3、2宏基因组 DNA 得提取获得高浓度、大片段、无偏好得环境样品总 DNA 就是宏基因组文库构建得难点之一。近年已有多种宏基因组DNA得提取纯化方法陆续建立
8、起来, 大体可分为两类: 一类就是直接提取法, 又称原位提取法。这类方法不经过样品中微生物得培养与分离, 通过化学法、酶解法或物理法直接破碎环境中得微生物细胞而使 DNA 得以释放, 并对 DNA 进行纯化。其中以 Zhou 法与 Tsai法最为常用。该法操作简便、省时、成本低, 所获得 DNA 具有较好得完整性, 并能够代表某一生境得微生物群落多样性。但该发放常会出现细胞裂解不完全或 DNA 与土壤杂质成分产生共沉淀而无法有效地去除等问题, 所以一般需要进一步得DNA纯化处理, 同时所提取获得得 DNA 片段较小(1 kb50 kb), 主要适用于小片段文库得构建; 另一类就是间接提取法,
9、即异位提取法, 就是利用离心介质或者梯度离心等方法先把微生物从环境样品中分离出来, 再按处理纯培养细胞得方法裂解微生物细胞提取 DNA。该法获得得宏基因组 DNA 受到胞外杂质污染干扰较少, 纯度较高、DNA 完整性好(20 kb500 kb), 适合构建大片段得宏基因组文库。但该法操作较繁琐、费时、成本高、偏差大、DNA 得率较低, 其产率只就是直接裂解法得 1%10%且获得得 DNA 往往不能完全代表样品所在生境得生态学多样性。本实验室对温泉淤泥、纸厂污泥、红树林淤泥、沼泽淤泥等 12 个环境样品得总 DNA 提取方法进行了摸索, 研究工作表明,直接提取法提取效率较高, 不容易丢失物种信息
10、, 能够获得 23 kb 左右得 DNA 片段。并首次加入漆酶来有效去处腐殖酸类物质, 比聚乙烯吡咯烷酮 (PVPP)处理效果更好, DNA 得率更高。而间接提取法 DNA 提取效率较低, 容易丢失物种信息。因此, 建议采用直接提取法获得环境样品得总 DNA, 以便分析环境样品微生物群落多样性信息。3、3 宏基因组文库得构建3、3、1 载体得选择载体选择在宏基因组技术中占有十分重要得地位。载体系统得选择主要依赖于DNA 提取质量、插入片段、质粒拷贝数、宿主菌及筛选方法。根据克隆载体得不同宏基因组文库可分为质粒文库、细菌/酵母人工染色体文库、噬菌体类载体文库。早期宏基因组文库主要以质粒载体与大肠
11、杆菌宿主细胞构建而成得小片段(15 kb)文库。该文库操作简便、拷贝数高、对 DNA 质量要求不高, 适合纯度低或剪切较严重得 DNA 模版。但插入片段小, 筛选量大, 活性比率低, 对大基因簇无能为力, 主要适用于分析新得基因序列信息及筛选编码代谢相关得单一基因或小操纵子。然而, 很多微生物活性物质就是其次生代谢产物, 代谢途径由多基因簇调控, 因此尽量插入大片段DNA以获得完整得代谢途径多基因簇就是很有必要得, 目前已有报道能容纳15 kb40 kb外源DNA得 Fosmid 文库与Cosmid 文库, 同时已经成功构建了容量高达 200 kb350 kb 外源 DNA 得细菌人工染色体文
12、库与酵母人工染色体文库。该文库不仅拥有巨大得插入片段载量, 而且稳定性好、筛选效率高、克隆表达能力强, 可获得基因簇表达活性物质。主要用于分析某一生境中微生物群落多样性及筛选由基因簇或多个基因控制表达得活性物质。但其操作较复杂繁琐、对 DNA 纯度要求较高, 且拷贝数低, 扩增较困难。此外, 噬菌体与其她病毒也可以作为构建宏基因组克隆文库得载体。噬菌体展示库就是一种十分有效得高通量筛选技术, 该技术通过对表面展示表达产物得亲与选择分离相应得 DNA 序列,能够从宏基因组中富集稀有 DNA 序列,但其局限性在于只能表达分子量小于50kD蛋白。3、3、2宿主细胞得选择不同得微生物种类所产生得活性物
13、质类型有明显差异。宿主菌株得选择主要考虑转化效率、重组载体在宿主细胞中得稳定性、宏基因得表达、目标性状(如抗菌)缺陷型等因素。其中 E、 coli就是最为常用得宿主细胞,其优点就是操作简单、繁殖迅速、培养代谢易于控制。但就是由于环境样品得总 DNA 有很大一部分为真核基因组 DNA, 其在细菌宿主中往往不能表达, 大大限制了这部分基因得筛选。最近已有报道利用链霉菌、假单胞菌等真菌作为受体来鉴定有关新抗生素生物合成得基因。但就是最近得生物信息学研究表明, 对于一个插入子(10 kb)得文库, 为寻找一个目得基因需要筛选 105106 个克隆, 这表明从复杂得宏基因组中筛选目得基因在技术上还存在着
14、其特殊得困难。因此, 宿主系统得进一步探索就是更有效得开发宏基因组资源得关键技术之一。3、4宏基因组文库筛选由于宏基因组文库容量较大, 目标克隆子得筛选一直就是宏基因组学技术中得瓶颈。近年来, 各种宏基因组文库筛选方法相继建立起来, 根据筛选原理大体分为两大类: 序列依赖性筛选法与非序列依赖性筛选法。 1)序列依赖性筛选法, 就是根据文库中得已知序列或保守序列来设计杂交探针或 PCR 引物, 从宏基因组文库中筛选目标序列。该法克服了功能筛选法中必须依赖表达后得活性产物进行检测, 效率较高。其中已知功能基因 PCR 扩增技术就是最为常用得序列依赖性筛选法。此外, DNA 微阵技术与整合子系统技术
15、也可以作为序列依赖性筛选法。例如 Wagner 等应用 DNA 微阵列技术对活性污泥中微生物得群落结构进行了研究, 获得了大量新得信息, Stokes 等利用整合子系统技术成功筛选到与 DNA 糖苷酶、磷酸转移酶与甲基转移酶同源得新基因。但就是该筛选法存在 2 个主要得缺陷: (1) 引物得设计依赖于已有得序列信息, 共同进化得 2 个功能相似得基因难于用“族特异性”引物区分开来, 因此很难发现新得功能基因; (2) 通过 PCR扩增功能基因, 一般只能获得结构基因得一个片段, 而不能获得完整得功能基因。 2)非序列依赖性筛选法, 其不依赖于任何已知序列信息, 仅根据文库克隆子产生得活性物质进
16、行筛选。其中以功能筛选法最为常用, 原理就是直接对目得克隆表达得性状在选择培养基上进行筛选, 已有报道成功筛选出产生木聚糖酶、纤维素酶、脂肪酶及抗菌活性得克隆子。该法筛选能够发现全新得活性物质或全长基因, 但工作量大、效率低, 生物转化得产物仅在少数情况下具有可见性状, 酶活性得检测受到研究方法得限制。此外, 由于受到酶活检测方法得限制, 大多数宝贵得酶资源不能通过上述基于活性得方法发掘出来, 近期基因陷阱技术筛选法倍受研究学者们得关注。其中, (1) 利用目得基因缺失得突变体宿主菌株, 转化后在选择性培养基上进行功能互补得生长特征来筛选。例如 Majernik 等通过缺陷型大肠杆菌为宿主菌构建土壤宏基因组文库, 筛选出了与 Na+/H+反向转运通道相关新基因; (2) 将宏基因组 DNA 随机克隆到无启动子得绿色荧光蛋白基因(GFP)前面, 然后通过荧光
