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1、菠萝蛋白酶的提取方法：(1) 沉淀法 沉淀法是粗提酶蛋白的方法之一，主要用于前期酶的初步分离和浓缩，常用的方法有盐 析法，有机溶剂沉淀法，聚乙二醇沉淀法，等电点沉淀法等。用新型吸附洗涤沉淀法和单宁 沉淀法也可以提取菠萝蛋白酶，操作简单，产率也较高，但酶的产量与单宁的用量密切相关， 而且所含单宁有毒，导致这种方法逐渐被淘汰了。以酒精为沉淀剂提取菠萝蛋白酶时，酒精 的加入量会对菠萝蛋白酶产生较大的影响，酒精的浓度太低时，不能使菠萝蛋白酶沉淀下来， 浓度太高容易使酶变性失活。酒精的浓度为 80%时，酶的收率最高。从茶叶中提取的多酚 类物质茶多酚也可用于菠萝蛋白酶的分离，用0.5%的茶多酚提取物对菠萝
2、汁中菠萝 蛋白酶进行沉淀最多可达78%，其最大沉淀率明显比单宁法高。(2)离子交换色谱法 离子交换色谱层析法是蛋白质研究领域内比较高效的纯化技术，目前国外用于分离菠萝蛋白 酶常用的离子交换剂有Sephacryl S-200柱、Mono S阳离子交换剂、S-Sepharose、弱酸性阳 离子交换树脂、CM-纤维素阳离子交换柱、Q阴离子交换柱。国内常用的有羧甲基纤维素(CMC)、二乙胺乙基纤维素(DEAE),酶的纯化过程通常是将若干色谱纯化技术联合使用 来实现的。Ota最早用SephadexG-75结合CM-SephadexC-25柱层析分离得到5种茎酶的组 分。用DEAE-52离子交换柱层析结合
3、Sephadex G-75分子筛柱层析色谱法纯化果酶，能 获得比活力为 12.5U/mg 的单一电泳纯酶制剂。( 3)固定化金属离子亲和色谱法 固定化金属离子亲和色谱法是以普通凝胶作为载体，连接上合适的螯合配体和足够暴露的金 属离子，制成亲和吸附剂，进行分离纯化蛋白质的方法。此法介于高特异性的生物亲和分离 法和低特异性的离子交换色谱法之间，对组氨酸基团有特异性。 Huali Nie 等(2008)首次 应用固定化金属亲和膜( IMAM) 肽-尼龙膜，这是一种将七肽共价固定到复合膜上作为 配体的新型尼龙膜，用其从菠萝中分离和提纯菠萝蛋白酶，可使菠萝蛋白酶纯化 15.4 倍， 回收率达 94.6%
4、，而且不会造成任何变性。固定化金属亲和层析技术正逐渐被采用， Pawan Gupta 等(2007)将菠萝蛋白酶成功固定在亚氨基二乙酸载体琼脂糖凝胶 6B 型中。 Cu2+ 与亚氨基二乙酸(IDA )的络合被用来作为螯合配体将单个组氨酸结合到菠萝酶上。固定化 高亲和性载体的制备是试图将可溶性交联菠萝蛋白酶制剂固定到铜 -亚氨基二乙酸-琼脂糖 凝胶上。( 4 )超滤法超滤法是在离心力或较高的压力作用下，选择适当孔径的超滤膜，使水和其他小分子物质通 过，而使所需酶蛋白截留的方法。利用超滤法提取酶蛋白，具有无相变、生物活性不易丧失、 得率较高，不会改变溶液糖酸比等特点。用超滤法浓缩有机溶剂提取的菠萝
5、蛋白酶产品质量 好，对环境污染少，可以实现清洁生产，酶粉得率比高岭土工艺高出 47%。超滤法分离提 取的粗酶比活力较单宁沉淀法高2.7倍，也比酒精沉淀法高。用超滤法浓缩提取菠萝蛋白酶 需要对操作条件进行研究，尽最大可能提高超滤效果，促进工业化生产。杨辉等研究认为压 力差在300kPa,透过液通量为50L/m2 h时即能保持较大的流量，又不会对酶活造成损失。 在对菠萝汁进行超滤的过程中，料液透过通量随压力差增加和循环速度的增大逐渐上升并趋 于稳定。用超滤法浓缩提取生物大分子时因不同膜材料的透过通量和截留率不同，而导致不 同的分离特性。用聚丙烯腈膜(PAN)膜浓缩工艺较适合对菠萝蛋白酶进行超滤浓缩
6、，可使 果菠萝酶回收率达93.3%,截留率达97.8%。用PSA膜超滤菠萝皮汁制得的菠萝蛋白酶酶活 总回收率为 65.7%。李兴，林哲甫用二氧化钛吸附菠萝果汁中的菠萝蛋白酶再用截留值2万 和 5 万的超滤膜超滤浓缩，能获得较高比活的果酶。得到的果酶活力回收率为54%，比活 力为911单位/mg。目前将纳米氧化锌吸附、陶瓷膜超滤浓缩和冷冻干燥法结合的综合性技 术已达到国际先进水平，创新性较好。（5）双水相萃取法 利用两种多聚物，或多聚物与盐在水相中的不相容性，可以从细胞破碎后的细胞碎片中直接 分离、纯化并浓缩蛋白质。该方法的优点是比较温和可在室温下进行，一般不造成酶的变性 失活，还可提高其稳定性
7、。与其它分离纯化方法相比，利用双水相萃取法有很多优点，如易 于放大、成本低、可以连续操作、并且是环境友好的。这就使其成为分离纯化生物分子的诱 人的替代方法，在国外进行了大量的应用。B.Ravindra Babu等（2008）首次使用该法从菠 萝中分离纯化菠萝蛋白酶和多酚氧化酶的混合物，结果使菠萝蛋白酶的纯度提高4.0倍，得 到约228%的活性回收率。双水相萃取法提供了一种有效的、经济上可行的分离纯化菠萝蛋 白酶的方法。在双水相体系中用PEO-PPO-PEO嵌段共聚物分离纯化菠萝蛋白酶，其活 性回收范围为 7.5%79.5%，纯化倍数0.11.25倍。在双水相体系中，各种参数如聚合物的 分子质量
8、、聚合物和形成相的盐浓度和分离体系的pH对分离纯化的结果影响较大。（6）反胶团萃取法 生物技术的发展为重要生物分子的生产开辟了一条新的途径，在选择性提取的生物分子中， 逆胶束有机相很有潜力发展为液液萃取的生物分离技术。反胶团是表面活性剂，使水滴稳定 分散在有机溶剂中，这种表面活性剂是双亲性的有机复合物，既亲脂也亲水。反胶团萃取法 有如下一些优点：不会造成原有功能或活性的损失、界面张力较低、易于规模化、有连续运 作的潜力。H.Umesh Hebbar等（2008）用溴化十六烷基三甲铵/异辛烷/正己醇/正丁醇和磺 酸钠/异辛烷的反胶束体系从菠萝废料的水提物中提取和初步纯化菠萝蛋白酶。用反向阳离 子
9、表面活性剂（CTAB ）胶束体系能使菠萝蛋白酶获得一个较好的活性回收率可达106%, 纯化5.2倍，而采用阴离子表面活性剂（AOT）贝I没有获得较好的产率。（7）新型纳米吸附剂法 随着一种以氧化铁纳米粒子为核心，聚丙烯酸为离子交换组的新型磁性纳米吸附剂的开发， 其在生物分离和生物医学领域已经被广泛应用。它具有高的离子交换容量和快速的吸附/解 吸率。这种纳米粒子用于菠萝蛋白酶的分离是很有效的。近年来，纳米纤维膜由于其非常大 的表面积和体积比、优越的机械性能引起人们的广泛关注， Haitao Zhang 等（2010）通过一 步静电纺丝技术以二甲基乙酰胺为溶剂制备出超细聚丙烯腈（PAN）纳米纤维膜
10、，用化学的 方法连接到壳聚糖的表面，共价连接到染料配体辛巴蓝上制成染料固定化亲和膜，而且可以 重复使用，膜的再生显示出良好的机械性和化学稳定性。这种新开发的染料亲和膜首次用于 菠萝蛋白酶的吸附，批次试验揭示出它具有一个很高的吸附菠萝蛋白酶的能力，可以实现高 效率的大规模的吸附，这种低非特异性结合的亲和膜对于纯化高纯度的菠萝蛋白酶是很有效 的。供试酶液的制备（纳米二氧化钛吸附法分离纯化效果明显好于高岭土吸附法和超滤浓缩有机 溶剂提取法，所得酶的比活力分别是后两者的1.94倍和3.81倍）清洗后菠萝茎在4C冷室 中预冷12h，组织捣碎机捣碎，加1倍0.05mol/L，pH6.0磷酸缓冲液（含5 m
11、mol/L的 EDTA）浸提，缓慢搅拌，浸提10min, 4层纱布过滤，离（4000rpm， 15min）,上清液即 为供试酶液，蛋白质含量为1.62 mg/mL。（菠萝果、皮中酶供试液制备方法同上）操作要点： 选取干净的菠萝茎，除杂，清水中漂洗三次，沥干，放入4C冷室中 预冷备用。预冷后茎用高速组织捣碎机打浆，加 0.05 mol/L， pH6.0 磷酸缓冲液浸提 10min， 4层纱布过滤，滤液在4000 rpm条件下，离心15min,取上清液，放入4C冷室中备用。1.纳米TiO2吸附法（纳米TiO2的用量直接影响吸附效果。用量不足，对酶的吸附不完全；用量过多，增加处理和洗脱难度，浪费资源
12、）（超滤过程中会发生浓差极化现象，导致菠萝蛋白酶的损失。在 压力较低时，随压力增大，通量呈直线上升，但随压力增大,膜逐渐被压实，浓差极化（膜 分离过程中的一种现象，会降低透水率，是一个可逆过程。是指在 超滤过 程中，浓差极化由于水透过膜而使膜表面的溶质浓度增加，在浓度梯度作 用下，溶质与水以相反方向向本体溶液扩散，在达到平衡状态时，膜表面 形成一溶质浓度分布边界层，它对水的透过起着阻碍作用。）现象增加，膜通量增幅变缓。）供试酶液中加纳米TiO2搅拌均匀f离心（4000 rpm, 15min）f取沉淀用柠檬酸缓冲液洗 脱f搅拌（30min） f离心（4000 rpm，15min） f取上清液f超
13、滤浓缩f冷冻干燥f酶制品。 操作要点： 吸附、洗脱:供试酶液置于玻璃或不锈钢容器中，加入纳米TiO2搅拌均匀，吸2030min， 离心弃上清，沉淀用柠檬酸缓冲液洗脱，离心取上清。超滤：洗脱液先用截留分子量为 40KD的超滤膜除去较大分子量的杂蛋白，再用截留分子量为20KD的超滤膜除去较小分 子量的杂蛋白及其它小分子杂质，采用加去离子水多次超滤。冷冻干燥：据共晶点确定 干燥参数。 纳米TiO2吸附能力再生：纳米二氧化钛吸附洗脱后，采用0.1mol/LNaOH溶 液浸泡，再用去离子水洗涤至中性，干燥后进行重吸附实验，吸附效果可恢复 90%以上。 通过正交试验得影响实验效果的因素主次为：纳米TiO2
14、用量吸附液pH吸附时间吸 附温度2 高岭土吸附法（高岭土吸附法生产工艺和操作都比较复杂，原材料消耗多，所需设备也 多，酶活总回收率及纯化倍数都较低，投资较大。）供试酶液f加4%高岭土，搅20min，10C吸附3060min-静置f吸出上清f沉淀用 16%NaOH调pH6.57.0f加7%9%NaCl,搅30minf压滤，滤液用1:3 （体积比）盐酸 调pH5.0f搅拌f加滤液量25%（NH4）2SO4f溶解一4C静置过夜f离心f沉淀f干燥（王 平诸等， 2002）。操作要点： 吸附：将供试酶液加入吸附槽中搅拌，同时加入4%的高岭土，搅拌约20min，在10C 吸附3060min,用虹吸排掉上清
15、液，收集高岭土吸附物。 洗脱：用16%的NaOH溶液调节吸附物的pH至7.0左右，再加入吸附质量为 7%9%的工业食盐，搅拌 30min 进行洗脱，然后迅速压滤，收集滤液。 盐析：将压滤液收集在盐析槽中，用1:3的盐酸调节pH至5.0左右，搅拌加入压滤 液质量25%的硫酸铵，待完全溶解后，4C过夜；然后离心，收集沉淀盐析物，干燥即为粗 酶。3. 超滤浓缩有机溶剂沉淀提取供试酶液f超滤浓缩f有机溶剂沉淀f干燥f酶制品。操作要点：超滤：供试酶液先用截留分子量为40KD的超滤膜除去较大分子量 的杂蛋白，再用截留分子量为 20KD 的超滤膜除去较小分子量的杂蛋白及 其它小分子杂质。 有机溶剂沉淀：将浓
16、缩液降温至04C，边搅拌边加入-20C的95% 乙醇，直至混合液中乙醇浓度为 50%，静置，使酶沉淀，移出上清液，即 为湿酶。 干燥：将湿酶在0C下减压干燥即得菠萝蛋白酶制品。2.4.4.5离子交换层析条件的确定（D.R马歇克等，1999.）pH：配制 pH5.0, 5.5，6.0，6.5，7.0，7.5，8.0 的 0.01 mol/L Tris-磷酸盐缓冲液（含 0.01 mol/LNaCl及1 mmol/LEDTA）。量取离子交换树脂ImL,用蒸馏水充分冲洗，定量到10mL 悬浆。取 7 个 2mL 离心管，每管加入 1mL 离子树脂悬浆，分别用上述缓冲液平衡。去 掉多余缓冲液。按纳米二氧化钛吸附法最佳条件制得供试酶样品,配成一定浓度酶液。取 1mL 样品与相应缓冲液等量加入离子树脂中,混匀,离心取上清液,测酶活性。离子强度： 取 4 支 2mL 离心管各加入 1mL 离子树脂悬浆,分别用含 0.1mo
