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1、实验五、Hela细胞传代培养及观察实验六、Hela细胞的HE染色及观察一、实验目的了解细胞传代培养的方法步骤，学习 H.E 染色。二、实验原理1. 培养的组织细胞根据细胞类型和供体年龄，有不同的传代能力。传代指将细胞 从一个培养瓶转移或移植到另一个培养瓶，传代培养指当原代细胞增殖到一定 密度后的培养，从开始传代后的细胞统称细胞系。2. H.E 染色指苏木精-伊红染色，染色后细胞核呈深蓝色，细胞质中不同成分呈不 同深浅的粉红色。三、实验材料1. 细胞传代：Hela细胞系，PBS溶液，DMEM培养基，双抗(100X,青霉素10000U/mL、 链霉素10000ug/mL),消化液：0.25%胰蛋白
2、酶一0.02%EDTA溶液2. H.E 染色：a. 4%甲醛-PBS溶液b. 苏木精染液苏木精0.5g，无水乙醇10mL硫酸铝钾25g，蒸馏水150mL完全溶解后，混合均匀，加热煮沸3 5min,加入蒸馏水至500mL，最后加入0.1g碘酸钠c. 盐酸酒精溶液： 0.5mL 盐酸、 100mL 70%乙醇d. 淡氨水：0.5mL氨水、100mL自来水e. 伊红染液：0.5g伊红B、100mL80%乙醇四、实验步骤1. 细胞传代1) 镜检，观察并记录细胞状态2) 吸弃培养基，加入1mL PBS溶液洗去残余培养基3) 向培养皿内滴加200uL消化液，37C消化5 min4) 吸出消化液，加500u
3、L含10%血清的DMEM培养基5) 按比例分盘，三分之一留原盘做H.E染色，三分之二换盘做凋亡诱导，每盘均补加培养基至 1.5mL6) 37C、5%CO2 培养2. H.E 染色1) 镜检：观察并记录细胞状态2) 吸弃培养基，以PBS溶液(1mL)漂洗2次3) 以固定剂固定15分钟4) 吸弃固定剂，以蒸馏水洗5) 加入苏木精染液(1mL，可重复使用)染色15分钟6) 以流动的自来水洗15分钟7) 加入 0.5%盐酸酒精溶液进行分色(数秒)8) 以蒸馏水洗9) 以流动的自来水洗3分钟10) 加入 0.5%氨水溶液进行返蓝处理(数十秒)11) 以流动的自来水洗后观察，效果好则以蒸馏水稍洗12) 加
4、入伊红染液染色(数秒)13) 以蒸馏水洗14) 观察,效果不好，用酒精洗去染液，重复 513步。得到结果并拍照。五、实验结果与分析1. 细胞传代观察：1) 消化液处理前：细胞呈不规则，形状多样，贴壁生长，细胞与细胞挤在一起， 贴壁数达约 70%，细胞核质分界可见，可以看到核内有折光度很低的深色核 仁。2) 消化液处理后：大部分细胞变圆，还是挤在一起，菱角不再分明，有少数细 胞已经浮起。3) 吹吸后：大部分细胞呈圆形浮起，晃动小皿时随水流运动，细胞大小基本一 致。2. H.E 染色观察1) 镜检：细胞大部分贴壁，约 30%，贴壁细胞形状多不规则，在显微镜下可以 观察到核质分界，也有圆形的贴壁细胞
5、，那是正在分裂的细胞；有少量悬浮 的圆形细胞。2) 固定：细胞形态保持完好3) 苏木精染色：细胞被染成蓝紫色，细胞核颜色深，核内染色也有一定的层次 感，如一些异染色质染色会比较深，核仁染色也会比较深；胞质颜色浅，较 均一。4) 流动自来水洗：染色稍浅，核质分界还是比较明显5) 分色：这一步我分色过了，结果核和质的颜色都变得很浅，直接导致后来的 失败。6) 自来水洗：核和质之间有一道白色的分界，核比质稍深7) 返蓝：核和质的对比更弱了。8) 伊红染色：核质可以看出分界但是不够明显，主题颜色为粉红9) 酒精脱色：颜色挥发至染色前，较透明，稍黄。10) 苏木精染色：这次染得比第一次深，细胞核几乎全部
6、染成蓝紫色11) 流动自来水洗：染色稍浅，核质分明，核染色深，不好分辨其中的不同成 分。12) 分色：颜色分层，可以看到核内有不同深浅的染色，胞质染色进一步变浅13) 自来水洗：没有太大变化14) 返蓝：染色有一点变蓝15) 自来水洗：没有太大变化16) 伊红染色：染了三次：第一次：稀释后滴加，洗得过快，几乎没有染上色； 第二次：还是太快了，染色很浅；第三次：染了约3 秒，可见胞质染红，核 质分界明显17) 拍照：此时由于排队太久，伊红颜色已经几乎完全洗去，而且多次处理使 细胞受到伤害，有的细胞形态发生改变，细胞边缘没有那么光滑，多次醇类 处理使细胞壁有一定的破损。但还是可以看到比较完好的细胞
7、，胞质为粉紫 色，核为蓝紫色。3. H.E.染色图片及分析，见下图：由图可见，细胞大都贴壁，形状不规则。染色结果不是特别理想，可以看出伊红的颜色几乎全部被洗掉了，因为等待照相的时间太长了，这也说明了伊红是一种亲和性比较弱的染料。图片中的细胞细胞膜界限不是很清楚，原因可能有两点，一是染料被洗掉了，所以不清楚；另一种可能是，多次用含醇的溶液处理，对细胞膜产生了一定的损伤，所以细胞膜有稍微裂解，细胞形态发生了变化。这和染色的要求是相悖的，好的染色应该在染色前后细胞形态不发生改变所以可以考虑换用一些对细胞膜伤害不那么大且亲和性较强的染料，比如一些水溶性的强亲和性染料。由于这是课堂实验，除了考虑染色效果
8、外，还不得不 考虑染色时间、成本和操作的简易型，所以使用这些染料也是可以的。六、讨论1. 判定组织培养的标准细胞存活且能够繁殖、保留细胞特色，实验可重复。这也是承认 Hanrson 所做 的组织培养是真正意义上的组织培养的原因。2. 体外培养的细胞的分类贴附型细胞（如成纤维型细胞、上皮细胞型细胞）和悬浮型细胞（如白细胞）3. 细胞培养用液的成分：平衡盐缓冲液、培养基（含糖、氨基酸、矿质元素等细胞生长所需营养物质）、 血清、抗生素、消化液、pH调整液4. 应该观察培养细胞的哪些方面形态，生长特性，细胞遗传，细胞转化及恶性程度5. 细胞培养中对细胞生存条件的控制基本营养物质：糖、氨基酸、矿质元素等
9、细胞生长所需营养物质生长刺激因子：一般采用血清温度：3537C, 37C活性最好，0C依然有活性，39C细胞死亡（细胞耐低温能力比耐高温强）气体：氧气和二氧化碳（与液体中氢氧根例子平衡，调节pH；降低氧分压） 氢离子浓度： pH水 无菌环境 其他（必须无光，因为光照会使细胞内如核黄素转化成有毒物质）6. 为什么操作要迅速 光照会使细胞内的一些物质（如核黄素、某些氨基酸）转化成有毒物质；太多 的操作也会对细胞造成一定损伤。7. 细胞冻存与复苏慢冻快融的原因 当细胞冷到零度以下，可以产生以下变化：细胞器脱水，细胞中可溶性物质浓 度升高，并在细胞内形成冰晶。 如果缓慢冷冻，可使细胞逐步脱水，细胞内不
10、 致产生大的冰晶；相反结晶就大，大结晶会造成细胞膜、细胞器的损伤和破 裂。复苏过程应快融，目的是防止小冰晶形成大冰晶，即冰晶的重结晶。8. 细胞传代中要注意的地方：1）操作迅速2）培养基和PBS溶液取出后要在37C水浴3）酶解要在37C中进行，酶解要完全，但时间不能太长，否则细胞活性有影 响4）吹吸的时候要尽量减少气泡产生，具体方法是：吸的时候不要吸满，吸好后 稍顿一下再吹，吹的时候不要把液体全部吹出。5）吹吸的时候要对着细胞吹，效率更高6）前后要镜检9. H.E 染色要注意的地方：1）随时镜检，由镜检结果决定加液量和处理时间2）加盐酸-酒精溶液和淡氨水都要快加快倒，尤其是盐酸-酒精溶液，时间
11、太 长或处理次数过多都可能导致染料被洗掉3）伊红染液可先稍稀释再加，时间一定要短，否则之前染的苏木精会被洗掉4）做好后及时拍照，否则伊红染液会被洗下10. 关于 Hela 细胞的形态HeLa 细胞株是由正常子宫颈细胞被一种人类乳突状瘤病毒转型成癌细胞的，它 属于癌细胞，所以可以多层生长。观察中其形态不规则，细胞核较大，因为其 分裂能力很强。有圆形贴壁细胞发生分裂。七、实验小结 这次实验让我们熟悉了无菌操作和原代培养及染色技术，我认为整个实验最重要的 是随时通过观察调整自己的操作，比如原代培养中的吹吸，如果吹吸了很多次镜检 还是发现细胞无法悬浮的话，就要考虑再次酶解，而不是一直埋头苦吹；后来的 H.E 染色这一点就体现得更明显了，老师给的加液量和时间都是非常灵活的，要求自己 按每次镜检的结果纵向比较来调整操作，每个人的细胞不同，操作习惯不同，于是 就要求每个人自己去探索，这是一个很有意义的过程。八、参考资料细胞生物学实验指导 王宏英、吴逸、常智杰、王伟 2007
